四环素对纳米细菌感染的人肾小管上皮细胞HK—2中CaSR、Claudin—14表达的影响

申茂磊 高存祥 郑丽英 王勤章 徐浩 郝志强 傅家豪 钱彪

中图分类号 R361+.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）19-2607-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.04

摘 要 目的：研究四环素对纳米细菌（NB）感染的人肾小管上皮细胞HK-2中钙敏感受体（CaSR）、紧密连接蛋白14（Claudin-14）表达的影響，为抑制肾结石的形成提供参考。方法：将HK-2细胞分为空白对照组、NB组和四环素组（NB+四环素），每组3个复孔，各组分别加入相应NB和药物后共培养24 h。采用透射电子显微镜观察各组细胞的形态和超微结构变化，运用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和Western blot法分别检测细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白的表达水平。结果：与空白对照组比较，NB组细胞膜结构破损，胞核裸露在外，微绒毛基本消失，线粒体数量较少，结构肿胀，细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；四环素组细胞膜结构完整，微绒毛结构稍紊乱，局部绒毛消失，部分线粒体结构肿胀不明显，细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与NB组比较，四环素组细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论：NB可能通过上调HK-2细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白的表达促进肾结石的形成，而四环素可能通过作用于NB降低CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白的表达抑制肾结石的形成。

关键词 四环素；纳米细菌；人肾小管上皮细胞HK-2；钙敏感受体；紧密连接蛋白14

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of tetracycline on the expression of calcium-sensing receptor （CaSR） and Claudin-14 in nanobacteria-infected （NB） human renal tubular epithelial cells HK-2， and to provide reference for inhibiting the formation of kidney stone. METHODS： HK-2 cells were divided into blank control group， NB group and tetracycline group （NB+tetracycline）， with 3 complex holes in each group. They were given relevant nanobacteria and drug for 24 h. Morphology and ultrastructural changes of cells were observed by TEM. mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 were measured by real-time quantitative PCR （qRT-PCR） and Western blot assay. RESULTS： Compared with blank control group， the damaged structure of cell membrane， exposed nucleus， disappeared microvilli， small number of mitochondria and swollen structure were found in NB group； mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 were increased significantly （P<0.05）. The complete structure of cell membrane， disordered structure of microvilli， disappeared local villi and not obvious swollen of some mitochondrial structure were found in tetracycline group； mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 were increased significantly （P<0.05）. Compared with NB group， mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 were decreased significantly in tetracycline group （P<0.05）. CONCLUSIONS： NB may improve the formation of kidney stones by up-regulating the mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 in HK-2 cells， while tetracycline may reduce the mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 by anti-NB effect so as to inhibit kidney stone formation.

KEYWORDS Tetracycline； Nanobacteria； Human renal tubular epithelial cells HK-2； CaSR； Claudin-14

肾结石是泌尿外科疾病之一[1]，该病的成因非常复杂，纳米细菌（Nanobacteria，NB）感染被认为是导致结石形成的主要原因之一[2]，有文献报道，90%以上肾结石患者的血液、尿液和结石中可以检测出NB感染[3]。国外学者通过观察研究发现，NB是一种具有超微结构的人体病原菌，可以黏附并损害肾小管上皮细胞，其菌体外周的羟磷灰石结晶外壳可以不断富集尿液中钙离子，與坏死细胞碎片共同参与形成结石[4]；还有研究显示，多数肾结石患者合并有尿钙重吸收障碍[5]，其高钙浓度尿液可以促进含钙结石的形成[6]，这些都提示NB引起的结石可能是含钙结石。有研究表明，钙敏感受体（Calcium-sensing receptor， CaSR）可以通过影响紧密连接蛋白-14（Claudin-14）的表达，引起尿液中钙离子浓度发生变化，导致高尿钙肾结石的形成[7]。然而由于NB的自我矿化特性，以至于众多的抗生素都对其无效，但是四环素能沉积在NB钙化的外壳上并穿透外壳发挥抗菌作用[8]，是为数不多的能在生理浓度下杀灭NB的抗菌药物之一，如有研究者通过研究口服四环素片治疗NB所致Ⅲ型前列腺炎发现，83.3%的患者症状得到改善，表明四环素可能通过抗NB治疗慢性前列腺炎[9]。但是四环素能否通过抗NB治疗影响人肾小管上皮细胞HK-2中CaSR、Claudin-14的表达，从而达到预防以及治疗NB所致肾结石的目的，目前尚无相关文献报道。随着医学技术的发展，结石的诊断和治疗都有了长足的进步，但传统的体外碎石治疗后患者的5年复发率仍高达41.8%[10]。因此，探究泌尿系结石的形成机制以寻找新的治疗手段是当前临床中亟待解决的难题。

本课题旨在通过实时荧光定量聚合酶链式反应 （qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）法检测NB对CaSR、Claudin-14基因和蛋白表达的影响，探讨四环素对NB感染的HK-2细胞中CaSR、Claudin-14表达的影响，为泌尿系结石的预防和治疗提供新的思路。

1 材料

1.1 仪器

CFX96 qRT-PCR仪（美国Bio-Rad公司）；ELX800酶标仪（美国 Bio-Tek公司）；JSM-6390LV透射电子显微镜（日本电气株式会社）。

1.2 药品与试剂

四环素（北京索莱宝科技有限公司，批号：IT0130，纯度：>95%）；DMEM培养基、1640培养基（美国Gibco公司，批号：10569010、22400071）；磷酸盐缓冲液（PBS）和胎牛血清（美国Hyclong公司，批号：SH30256.01、SH30084.03）；兔抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体、兔抗Claudin-14抗体、小鼠抗CaSR抗体（美国Abcam公司，批号：ab8227、ab19035、ab19347）；抗兔辣根过氧化物酶、抗小鼠辣根过氧化物酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（北京中衫金桥有限公司，批号：2B-2301、2B-2305、TA-08）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号：P0009）；化学发光（ECL）液（德国Merck-Millipore公司，批号：WBULS0100）；Trizol试剂（美国Life-Invitrogen公司，批号：15596026）；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（日本TaKaRa公司，批号：RR037A、RR820L）；引物均由上海生工生物公司设计合成；其余试剂均为分析纯。

1.3 细胞

人肾小管上皮细胞HK-2购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

2 方法

2.1 NB的培养

参照褚浩等[11]的方法进行操作。收集新疆石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科临床确诊肾结石且未应用药物或手术治疗患者的尿液，将尿液依次经过0.45、0.22 μm一次性正压滤器过滤，加入高糖培养基后放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养15 d，细菌进入对数生长期。

2.2 分组与给药

选取HK-2细胞，随机分为3组，分别为空白对照组、NB组和四环素组。空白对照组只加入胎牛血清和1640培养液；NB组加入2 mL的提前配制好的含NB菌液的培养基[650 nm波长的光密度（OD650 nm）为0.7]；四环素组加入用培养基提前配制好的含四环素和NB的培养基（四环素5 mg/L，NB的OD650 nm为0.7）。

2.3 细胞形态的观察

取HK-2细胞接种于6孔板上，每孔约4×106个细胞，按“2.2”项下加入相应培养基和药物，共培养24 h后，提取各组细胞制成细胞悬液，将提取好的悬液12 000 r/min离心后转移至EP管内，用PBS浸泡10 min后弃上清；用预冷的3%戊二醛固定2 h，PBS洗2次，每次3 min；再加入1%锇酸固定2 h，PBS缓冲液洗2次，每次同样洗3 min；梯度乙醇脱水，包埋后在80 ℃恒温条件下聚合过夜，最后进行超薄切片、负染色，于透射电子显微镜下观察各组细胞形态与超微结构变化。

2.4 qRT-PCR检测细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA表达

将HK-2细胞接种于6孔板中，每孔约4×106个细胞，按“2.2”项下加入相应培养基和药物，每组3个复孔，共培养24 h后应用Trizol提取总RNA，为防止RNA降解，全程操作在冰上进行，然后测定所提取RNA纯度与浓度，将所提取的RNA反转录成cDNA后进行CaSR、Claudin-14和β-actin mRNA的PCR检测。反应条件按照试剂盒说明书设定。以β-actin为内参，计算各组细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA的相对表达量。引物序列与片段长度见表1。

2.5 Western blot法检测细胞中CaSR、Claudin-14蛋白表达

将HK-2细胞接种于培养皿中，按“2.2”项下加入相应培养基和药物，共培养24 h，用PBS缓冲液润洗细胞2次，加入细胞裂解液，收集细胞于1.5 mL EP管中，冰浴30 min后在4 ℃、10 000 r/min条件下离心5 min，收集上清液。BCA法进行蛋白定量。各组取40 μg蛋白，10%丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，300 mA恒流转膜60 min，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，于小鼠抗CaSR抗体（稀释比例1 ∶ 500）和兔抗Claudin-14抗体（稀释比例 1 ∶ 500）中4 ℃下孵育过夜，用TBST缓冲液漂洗4次，每次5 min，再分别加入抗小鼠辣根过氧化物酶和抗兔辣根过氧化物酶（稀释比例1 ∶ 10 000），室温孵育2 h，用TBST缓冲液漂洗4次，每次5 min，加入ECL化学发光液，曝光X光胶片，获取的结果通过Quantity One软件进行灰度值分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，计算CaSR、Claudin-14的相对表达量。试验重复3次。

2.6 统计学方法

运用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞形态

空白对照组HK-2细胞膜结构完整正常，膜外微绒毛数量丰富、排列规则，双层核膜结构正常，核周隙正常，线粒体形态正常，线粒体脊排列规则有序，未见肿胀或萎缩。NB组HK-2细胞膜结构破损，胞核裸露在外，微绒毛基本消失，线粒体数量较少、结构肿胀。四环素组HK-2细胞膜结构完整，微绒毛结构稍紊乱，局部绒毛消失，部分线粒体结构肿胀不明显。各组细胞的透射电子显微镜图见图1。

3.2 细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA表达水平

与空白对照组比较，NB组和四环素组细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA表达水平明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与NB组比较，四环素组细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA表达水平明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。各组细胞中CaSR、Claudin-14 mRNA的相对表达量见图2。

3.3 细胞中CaSR、Claudin-14蛋白表达结果

与空白对照组比较，NB组和四环素组细胞中CaSR、Claudin-14蛋白的表达水平明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。与NB组比較，四环素组细胞中CaSR、Claudin-14蛋白的表达水平明显降低（P<0.05），差异均有统计学意义（P<0.05）。各组细胞中CaSR、Claudin-14蛋白的电泳图见图3，相对表达量见图4。

4 讨论

泌尿系统结石的病因非常复杂，其涉及到多种因素如药物副反应、遗传易感性等[12-13]。近年来，有文献报道NB在肾结石形成过程中起关键性的作用[5]。NB广泛存在于人体血液、尿液及组织器官中，与体内多种病理性钙化过程密切相关[14]。Garcia CE等[15]以NB建立大鼠肾结石模型，解剖发现大鼠肾小管广泛钙化，提出NB是形成结石的主要原因。贾宏伟等[16]通过大鼠尾静脉注射NB，8周后发现大鼠远曲小管和近曲小管管腔出现不规则结晶体。Xin H等[17]从肾结石患者血液中提取NB，并与人肾小管上皮细胞HK-2共培养，建立体外模型，发现NB通过脂质过氧化反应对HK-2细胞造成损伤。本课题组前期通过大鼠尾静脉注射NB，同样发现肾脏组织中有结晶颗粒出现[11]。

CaSR是一种与钙代谢调节密切相关的G蛋白偶联血浆细胞膜受体[18]。有研究证明，肾小管通过CaSR、Claudin-14通路调控钙的代谢，对于Claudin-14基因敲除的大鼠，CaSR失去了对钙离子代谢的调控作用[19]。本研究通过从确诊的肾结石患者尿液中培养NB，然后与HK-2细胞共同培养，于24 h后检测各组细胞中CaSR和Claudin-14的mRNA和蛋白表达水平，研究结果显示，NB组中的CaSR和Claudin-14无论在mRNA水平还是蛋白水平均高于空白对照组，表明NB可能是通过上调CaSR和Claudin-14的表达，导致尿液中钙离子浓度发生变化而促进高尿钙肾结石形成[7，20]。

四环素是为数不多的能在生理浓度下杀灭NB的抗菌药物之一，其可以穿透NB的钙质外壳从而发挥抗菌作用。有多篇研究报道，四环素在治疗NB相关的慢性前列腺炎等方面均取得了不错的效果[9，21]。Hu WG等[3]通过尾静脉注射NB建立大鼠肾结石模型，发现灌服四环素可减少大鼠24 h尿乳酸脱氢酶以及肾小管结晶数，推测四环素可能有抑制肾结石形成的作用。但是四环素能否通过抗NB对肾小管上皮细胞HK-2中CaSR和Claudin-14的表达产生影响，目前尚未见相关文献报道。本研究发现，与四环素、NB共培养的HK-2细胞中CaSR和Claudin-14的mRNA和蛋白的表达水平均明显低于NB组，表明四环素可能通过抑制NB降低HK-2细胞中CaSR和Claudin-14的表达影响肾结石的形成，这一结果进一步确认了四环素在肾结石的预防和治疗方面的有效性，对于该病在临床上的诊治具有积极的意义。

综上所述，本研究初步证实NB可能通过以下途径导致肾结石：NB感染HK-2细胞后上调CaSR、Claudin-14表达，导致高钙尿，促进钙离子向NB的富集，进而形成结石；而四环素又可以抑制这一过程。本课题组后期将进一步验证不同浓度的四环素对NB感染HK-2细胞中CaSR、Claudin-14的抑制作用，以期证实四环素杀灭NB可能是预防和治疗结石的一个新的方向。

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（收稿日期：2018-04-24 修回日期：2018-07-16）

（编辑：邹丽娟）