利用网络药理学方法研究交泰丸治疗糖尿病的作用机制

2018-09-10杨释岑刘志强刘和波王博龙

中国药房 2018年19期

杨释岑刘志强刘和波王博龙

中圖分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）19-2656-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.15

摘要目的：利用网络药理学研究交泰丸治疗糖尿病的作用机制。方法：以化合物的口服药物生物利用度（OB）和类药性（DL）为标准，依据中药系统药理学技术平台（TCMSP）等数据库、反向分子对接服务器（DRAR-CPI）、人类基因组注释数据库（Genecards）预测和筛选交泰丸的活性成分及治疗糖尿病的作用靶点。借助Cytoscape 3.5.1软件构建交泰丸活性成分-作用靶点网络，借助STRING平台构建靶蛋白相互作用网络，通过生物学信息注释数据库（DAVID）对靶点基因本体（GO）生物过程及京都基因与基因组百科全书（KEGG）中代谢通路进行分析。结果：从交泰丸中筛选得到16个活性成分，其作用于61个糖尿病靶点，关键靶点包括白细胞介素（IL）-4、IL-10、胰岛素受体等，调节包括磷酸肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路、谷胱甘肽代谢通路、Janus激酶/信号转导子和转录激活因子信号通路、细胞色素P450酶药物代谢、丙酮酸代谢通路和肾素-血管紧张素系统等在内的25条代谢通路，参与蛋白质磷酸化、氧化还原、信号转导、谷胱甘肽代谢、炎症反应、免疫反应等多种生物过程。结论：交泰丸及其活性成分能通过多个靶点、多条通路发挥治疗糖尿病的作用；本研究结果为进一步研究交泰丸药理药效机制提供了参考依据。

关键词交泰丸；糖尿病；网络药理学；活性成分；作用靶点；代谢通路；生物过程

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of Jiaotai pills in the treatment of diabetes by using network pharmacology. METHODS： By using oral bioavailability （OB） and drug like （DL） of compound as reference， according to databases as Traditional Chinese Medicine System Pharmacology （TCMSP） Technology Platform， reverse molecular docking server （DRAR-CPI） and human genome annotation database （Genecards）， the active ingredients of Jiaotai pill and the target of diabetes therapy were predicted and screened. Using Cytoscape 3.5.1 software， the active ingredient-target network of Jiaotai pill was built； using STRING platform， target protein interaction network was established. The target GO biological process and the metabolic pathways of the Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） were analyzed through the DAVID database of biological information. RESULTS： Totally 16 active ingredients were screened from Jiaotai pill and acted on 61 diabetes targets. Key target included IL-4， IL-10， insulin receptor， etc. Regulation included 25 KEGG signal pathways， such as PI3K-Akt signal pathway， glutathione metabolic pathway， Jak-STAT signal pathway， CYP450 enzyme metabolism of drug， pyruvate metabolism pathway， renin-angiotensin system. It participated in many biological processes such as protein phosphorylation， oxidation-reduction， signal transduction， glutathione metabolic， inflammatory response and immune response. CONCLUSIONS： Jiaotai pills and its active ingredients play hypoglycemic effect through various target and multiple pathway. This study provides reference for further studying pharmacological mechanism of Jiaotai pills.

KEYWORDS Jiaotai pills；Diabetes；Network pharmacology；Active ingredients； Target； Metabolic pathway； Biological process

糖尿病属于中医学“消渴”范畴，其病因病机与多种因素相关，张建永等[1]研究发现，糖尿病的发病与“肾水不能上济心火，心火不能下温肾水”所致的心肾不交密切相关。交泰丸是治疗心肾不交的经典方剂，由黄连、肉桂两药配伍而成，黄连苦寒，清降心火以交肾水，肉桂辛热，温升肾水以济心火，可用于治疗心肾不交所致的糖尿病[2-3]。南晓强等[3]研究发现，对于2型糖尿病伴失眠患者，交泰丸具有降低血糖、缓解失眠的功效。邹欣等[4]发现交泰丸可以改善胰岛细胞凋亡，增加胰岛素的分泌，改善大鼠糖耐量。以上研究表明交泰丸治疗糖尿病有一定疗效。但交泰丸中涉及有效成分较多，可能通过多靶点、多通路进行作用，但其作用机制仍不明确，特别是其抗糖尿病的系统药理学机制也不清楚。网络药理学目前是研究药物作用机制的一种新方法，已广泛应用于各种中药复方的研究，为中药复杂的作用機制的研究提供了新思路[5]。因此，本研究借助网络药理学的技术与方法，对交泰丸主要化学成分及其治疗糖尿病的作用机制进行较全面系统地分析，为进一步研究其药理作用机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件

中药系统药理学分析平台与TCMSP数据库[6]（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；反向分子对接服务器DRAR-CPI（https：//cpi.bio-x.cn/drar/，服务器以Z′ -score表示化合物与靶蛋白的亲和力，规定Z′ -score<-0.5时化合物与靶点有潜在结合的可能性[7]）；通用蛋白质数据库UniProt（http：// www.uniprot. org/uploadlists/）；人类基因数据库Genecards（http：//www.genecards.org/）；蛋白质互作平台STRING V 10.5（https：//string-db.org/）；生物学信息注释数据库DAVID V 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）。

1.2 主要化学成分的收集与筛选

利用TCMSP数据库收集交泰丸中黄连、肉桂的主要化学成分；根据化合物的药动学参数中口服生物利用度（OB）>30%、类药性（DL）>0.18的标准[6]，并结合文献报道筛选出候选化合物，最后统一保存为.mol2 格式文件。

1.3 分子对接与药物作用靶点的筛选

登陆DRAR-CPI服务器，对交泰丸活性成分进行模拟分子-靶蛋白对接，为了提高精准率，本研究选择Z′ -score<-1.5的高精度靶蛋白作为候选药物作用靶点。通过UniProt数据库将得到的药物作用靶蛋白编号（PDB ID号）转换成Genecards数据库对应的基因名称（Gene name）。在Genecards数据库中输入关键词“Diabetes”，得到糖尿病相关靶基因。最后将糖尿病靶基因与药物作用靶点基因映射筛选，找出两者的交集基因，得到交泰丸治疗糖尿病的靶点。

1.4 活性成分-糖尿病靶点网络的构建

以网络拓扑属性分析软件Cytoscape 3.5.1软件建立交泰丸的药物-靶点-疾病网络。在该网络中，节点代表化合物、靶蛋白，边代表化合物-靶点的相互作用。采用Cytoscape 3.5.1软件中“Network analyzer”功能，对网络的拓扑属性进行分析，计算其“节点度值分布（Node degree distribution）”“介数中心性（Betweenness centrality）”2个重要网络拓扑参数[8-9]（度值反映了一个节点与其他节点的连接数目，介数是网络中所有最短路径中经过该节点的路径的数目占最短路径总数的比，度值和介数是量化一个节点在网络中的重要性的重要拓扑参数，高的度值和介数值节点是新药发现和靶点预测的重点）。最后利用网络拓扑属性分析交泰丸治疗糖尿病的主要活性成分。

1.5 靶蛋白相互作用网络的构建

为研究交泰丸治疗糖尿病的靶蛋白之间的相互作用，在STRING平台构建其靶蛋白相互作用（PPI）网络。物种设为“Homo sapiens”（人类），最低相互作用阀值设为中等置信度“Medium confidence”0.4，其余参数保持默认设置。并运用Cytoscape 3.5.1对PPI网络进行拓扑属性研究，筛选并讨论PPI网络中关键靶蛋白。

1.6 京都基因与基因组百科全书通路富集与基因本体生物过程分析

根据上述结果，采用生物学信息注释数据库DAVID 6.8，对交泰丸治疗糖尿病的靶基因采用京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and gno- mes，KEGG）数据库进行通路富集和基因本体（Gene ontology，GO）生物过程富集，以分析交泰丸治疗糖尿病靶点的主要代谢通路及GO生物过程（以P<0.05判断相关）。

2 结果

2.1 交泰丸主要活性成分的筛选

利用TCMSP等数据库进行文本挖掘，分别从黄连、肉桂中收集到化学成分96、200个。根据OB>30%、DL>0.18的原则，再结合文献[10-12]报道，补充一些OB、DL值虽然较低，但含量较高、有药理作用的活性成分，如肉桂醛、醋酸桂皮酯、异甘草素、原花青素等，最终得到交泰丸主要活性成分共16个，见表1。

2.2 交泰丸作用靶点预测

Z′ -score<-1.5的共有176个靶蛋白，将此结果利用UniProt数据库转换成对应的基因名称，共得到176个人源靶基因。通过Genecards数据库挖掘到糖尿病相关靶基因3 693个。将176个药物作用靶基因与3 693个糖尿病相关靶基因映射，得到61个共同靶基因，预测为交泰丸治疗糖尿病的靶基因。

2.3 活性成分-糖尿病靶点网络

交泰丸活性成分-糖尿病靶点网络图见图1。

如图1所示，以61个靶基因作为交泰丸治疗糖尿病的靶点，建立交泰丸活性成分-糖尿病靶点网络图，共有77个节点、103条边。节点代表了活性成分及对应的潜在靶点，103条边代表了活性成分与靶点的相互作用，交泰丸共有16个活性成分作用于相同或不同的靶点，网络图充分体现了交泰丸多成分、多靶点治疗糖尿病的机制。各活性成分的拓朴参数见表2。

经计算，该网络度值平均为6.44，介数平均为0.11。由表2可知，黄柏酮、肉桂醛、肉桂酸、原花青素、甲基黄连碱、黄连碱等6种成分度值与介数均超过了平均值，提示这些成分是交泰丸治疗糖尿病的主要活性成分。

2.4 靶蛋白PPI网络分析

靶蛋白PPI网络见图2。

如图2所示，交泰丸靶蛋白PPI網络有51个节点（10个靶蛋白未参与蛋白的相互作用）、101条相互作用连线。

经计算，PPI网络中度值平均为4.08，介数平均为0.07。将度值、介数均排序在前1/3的靶蛋白（均排名前17的靶蛋白）建立交集，筛选出度值高、介数大的靶蛋白共有8个，提示这些靶蛋白是交泰丸抗糖尿病PPI网络中的关键靶点，在该网络中发挥了关键作用。关键靶点及拓扑参数见表3。

2.5 KEGG代谢通路分析

交泰丸治疗糖尿病的61个靶基因中有55个富集在KEGG代谢通路中，一共涉及25条KEGG代谢通路（P<0.05），其中与糖尿病明显相关的、基因数目较多的主要代谢通路有：磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路（PI3K-Akt）、谷胱甘肽（GSH）代谢通路、Janus激酶/信号转导子和转录激活因子（Jak-STAT）信号通路、细胞色素P450（CYP450）酶药物代谢通路、丙酮酸代谢通路、肾素-血管紧张素系统。另有神经营养因子信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路、胰岛素信号通路、胰岛素抵抗信号通路、Foxo信号通路，支链氨基酸（缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸）降解信号通路虽然不满足P<0.05，但也参与了交泰丸治疗糖尿病的过程。由此可见，众多因素间相互作用，共同影响，促进糖尿病的发生发展，而交泰丸可以通过调节多种代谢通路发挥治疗糖尿病的作用。KEGG中代谢通路与靶基因见表4。

2.6 GO生物过程分析

交泰丸治疗糖尿病的GO 生物过程富集结果显示与糖尿病有关、基因数目较多的生物过程有蛋白质磷酸化、氧化还原、信号转导、GSH代谢、炎症反应、免疫反应、肝细胞生长因子刺激的细胞反应、B细胞分化、IL-6产生的负调控、支链氨基酸分解代谢过程等，见表5。

表5结果提示，糖尿病的发生涉及多种生物过程，而交泰丸可以通过调节机体多种生物过程来治疗糖尿病。

3 讨论

3.1 交泰丸活性成分与靶标探讨

交泰丸中黄连、肉桂及其小檗碱、肉桂醛、肉桂酸等主要活性成分显示出了降糖作用，其机制可能与改善胰岛细胞功能、促进胰岛素分泌、干预胰岛素信号传导通路有关[13]。有研究[14]显示，肉桂中部分黄酮类化合物可促进糖原合成、增加糖原酶活性，从而降低血糖、调节脂质代谢；肉桂酸也被证实可促进胰岛素分泌。黄连中小檗碱作为腺苷酸活化的AMPK激活剂，在调节葡萄糖和脂类代谢、抑制胰岛素抵抗方面具有重要作用[15]。此外，药动学研究[16]发现肉桂与黄连具有协同作用，能促进彼此吸收。邹欣等[4]研究发现交泰丸治疗糖尿病模型大鼠的效果显著优于单用黄连或肉桂。除上述活性成分外，本研究得到的交泰丸活性成分-糖尿病靶点网络图还显示黄柏酮、肉桂醛、肉桂酸、原花青素、甲基黄连碱、黄连碱的度值与介数也较高，可作用于多个糖尿病靶点，提示这些化学成分很可能参与了交泰丸的降糖作用，值得进一步研究。PPI网络分析结果发现，IL-4、IL-10、INSR等8个靶标是PPI网络中主要靶蛋白，IL-4、IL-10与1型糖尿病的发生发展密切相关[17-18]，因此，调节IL-4、IL-10对治疗糖尿病具有积极意义。而汪健红[19]发现不同配伍比例的交泰丸能显著调节INSR含量与酪氨酸磷酸化水平，治疗糖尿病效果显著。总之，本研究运用网络药理学方法发现交泰丸可能通过与以上靶点直接、间接作用而发挥糖尿病治疗效果。

3.2 交泰丸信号通路探讨

PI3K-Akt 信号通路是胰岛素的主要下游分子通路，对调节糖、脂代谢具有重要作用。PI3K-Akt 信号通路阻滞及下游靶蛋白功能异常可引起胰岛素抵抗，继而导致2型糖尿病的发生[20]。GSH信号通路参与了葡萄糖诱导的胰岛素分泌，增加血浆中GSH的比例可改善糖尿病患者外周胰岛素的作用、增加胰岛素的敏感性[21]。活化的 Jak-STAT 信号通路通过诱导炎症细胞活化、促进炎症介质表达、增加促炎因子产生等途径，导致糖尿病肾组织炎性损伤，最终引起糖尿病肾病[22]。CYP450酶也对改善糖尿病抵抗、保护胰岛B细胞的功能、延缓糖尿病的发展具有重要作用[23]。氧化应激反应增强是糖尿病各种并发症形成和进展的重要环节，而丙酮酸可通过阻止超氧化物的形成防止氧自由基的产生、清除氧自由基，具有防止氧化损伤的作用[24]。肾素-血管紧张素系统可干扰胰岛内分泌功能、损伤胰岛B细胞，引起胰岛素抵抗[25]。神经营养因子通路与糖尿病机制相关，神经营养因子透过血脑屏障到达中枢并作用于中枢，与其特异性受体结合后通过 ERK1/2 信号通路或PI3K信号通路作用于神经细胞，引起血糖的变化[26]。 AMPK与糖尿病密切相关，已成为2型糖尿病的重要治疗靶点[27]。胰岛素信号通路与胰岛素抵抗、糖尿病直接相关[28-29]。Foxo信号通路与支链氨基酸代谢等通路也与糖尿病的发生、发展具有密切关系[30-31]。

3.3 交泰丸生物过程探讨

交泰丸治療糖尿病的GO 生物学过程富集涉及蛋白质磷酸化、氧化还原、信号转导、GSH代谢、炎症反应、免疫反应等多种生物过程。其中氧化还原平衡的破坏程度与糖尿病的发生发展相关，糖尿病患者体内氧化应激水平增高，可使胰岛B细胞受损，从而影响胰岛素分泌，使机体呈现高血糖状态，在氧化应激和高血糖的恶性循环下，最终影响了糖尿病的发生发展[32]。慢性糖尿病患者发生感染的机率较高，提示高血糖状态下伴有免疫功能低下[33]。免疫和炎症机制在糖尿病肾病和糖尿病心肌病的发生发展中也发挥了重要作用，主要体现在免疫细胞激活以及促炎细胞因子表达方面[34-35]。胰岛素信号转导通路与胰岛素抵抗信号转导通路涉及炎症细胞因子、转录因子、各蛋白激酶磷酸化以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用，炎性细胞因子等通过干扰胰岛素正常信号转导通路，激活胰岛素抵抗信号转导通路，最终导致胰岛抵抗并发生2型糖尿病[36]。肝细胞生长因子（HGF）可抑制胰岛B细胞的凋亡、促进胰岛B细胞增殖、增强胰岛功能，继而延缓糖尿病肾衰，其作用机制可能是通过激活Akt B和BCL-xl等细胞信号来实现的[37]。IL-6还可引起血管内皮功能损伤，从而导致糖尿病血管病变的发生[38]。活化的B淋巴细胞通过分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IL-6等促进自身分化及增强免疫反应，也可通过分泌抗体、与其他淋巴细胞相互作用等途径，间接地影响1型糖尿病的发生发展，这也可能是交泰丸治疗糖尿病的机制之一[39]。

综上所述，本研究通过网络药理学的技术与方法，阐明了交泰丸活性成分、靶点、通路之间相互作用关系，发现交泰丸及其活性成分能通过多个靶点、多条通路发挥抗糖尿病的作用，为进一步研究交泰丸药理药效机制提供了参考依据。

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