雷公藤属植物叶片中萜类成分的差异性

郭思远 马宝伟 吴晓毅 李佳 高伟 黄璐琦

摘要 目的：测定雷公藤属植物叶片中5种萜类成分的含量并比较差异，研究3个物种间的化学亲缘关系。方法：采用HPLC法测定28批雷公藤属植物叶片中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚新内酯、雷酚内酯和雷公藤红素5个成分的含量，并进行方差分析和聚类分析。结果：雷公藤属植物叶片中，雷公藤甲素、雷酚内酯和雷公藤红素的含量差异有统计学意义（P<0.05）；雷公藤内酯酮和雷酚新内酯含量差异无统计学意义（P>0.05）。运用系统聚类将28批雷公藤属植物聚为4类：第I类为东北雷公藤和昆明山海棠；第II类为雷公藤；第III类为雷公藤；第IV类为雷公藤和昆明山海棠。结论：雷公藤属植物叶片中部分萜类成分含量差异明显。东北雷公藤与雷公藤化学亲缘关系较远；昆明山海棠混在2者之间，与2者无明显区分。

关键词 雷公藤属；萜类成分；含量测定；化学分类

Abstract Objective：To study the relative relationship among the three species of Tripterygium genus by measuring the contents of 5 terpenoid compositions in plant leaves of Tripterygium genus and comparing the differences.Methods：HPLC was used to measure the 5 composition contents including Triptolide，Triptonide，Neotriptophenolide，Triptophenolide and Tripterine in 28 batches of plant leaves of Triptergium genus.ANOVA and cluster analysis were also performed to verify the results.Results：There were significant differences among the contents of Triptolide，Triptophenolide and Tripterine in the plant leaves of Triptergium genus （P<0.05）； There was no significant difference between Triptonide and Neotriptophenolide.Hierarchical clustering was used to divide the 28 batches of plants of Triptergium genus into 4 kinds：I：Tripterygium regelii Sprague et Takeda and Tripterygium hypoglaucum； II：Tripterygium； III：Tripterygium； IV：Tripterygium and Tripterygium hypoglaucum.Conclusion：The differences of some contents of terpenoid compositions in plant leaves of Tripterygium genus were significant.The relative relationship of Tripterygium regelii Sprague et Takeda and Tripterygium was distant； Tripterygium hypoglaucum was between the two，which had no significant difference.

Key Words Tripterygium genus； Terpenoid composition； Content determination； Chemotaxonomy

中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.002

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）、东北雷公藤（Tripterygium regelii Sprague et Takeda）和昆明山海棠（Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.）3者均属于卫矛科雷公藤属植物。雷公藤为传统中药，又名黄藤、黄腊藤、断肠草等[1]。药理研究显示，其有较好的抑制免疫、抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等作用[2]，临床上主要用于肾病综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等疾病的治疗[3]。目前，雷公藤和昆明山海棠可作为药用植物，而东北雷公藤尚无用药历史[4]。

文献报道[4-5]显示，综合形态特征、生物特性和地理分布分析，认为雷公藤和昆明山海棠应划分为同一物种的2个类型，将分布于浙江和福建等海拔300～500 m以上的物种划分为雷公藤种内的一个新变形，即中间型雷公藤[5]。有文献通过RAPD分子标记方法研究3者遗传关系和遗传多样性，结果显示东北雷公藤明显与其他种有显著地遗传差异可作为一个独立物种，而雷公藤与昆明山海棠之间存在大量的中间类型，中间类型连接了这2个种，建议将2个种合并。

现代研究发现，雷公藤中含有二萜类、三萜类、生物碱类、倍半萜类等活性成分[6-7]。本实验以雷公藤的萜类活性成分：雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚新内酯、雷酚内酯和雷公藤红素为指标，对不同产地的雷公藤叶片、东北雷公藤叶片和昆明山海棠叶片进行含量测定，并参照药用植物化学分类研究方法[8]对样品进行系统聚类分析，为进一步研究3者萜类含量差异和物种分类提供化学角度支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（Agilent 1200，安捷伦科技有限公司），冷冻干燥机（Alpha 1-2LDplus，德国格马有限责任公司），混合球磨仪（MM400，德国RETSCH公司），循环水式多用真空泵（SHB-III，郑州长城科工贸有限公司），数显恒温水浴锅（SB-1100，上海爱朗仪器有限公司），低速台式离心机（SIGMA 1-14，德国Sigma实验室离心机股份有限公司）。

1.2 试剂 雷公藤甲素（成都曼思特生物科技有限公司生产，生产批号MUST-14092510），雷公藤内酯酮（成都曼思特生物科技有限公司生产，生产批号MUST-14111115），雷酚新内酯（药渡经纬信息科技有限公司生产，生产批号YD0000883-170220），雷酚内酯（上海源叶生物科技有限公司生产，生产批号Y25A3S1），雷公藤红素（成都普思生物科技有限公司生产，生产批号R0130198）；上述对照品HPLC纯度≥98%。乙腈（色谱纯，Fisher Chemical），甲醇（分析纯，北京化工厂生产），磷酸（色谱纯，北京现代东方精细化学品有限公司生产），DMSO（纯度>99.5%，SIGMA-ALORICH中国公司生产），娃哈哈纯净水（纯化水，娃哈哈宏振饮料有限公司生产）。

1.3 分析样品 本实验所用雷公藤属植物叶片由本课题组野外采集，其基原植物经鉴定为雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）、东北雷公藤（Tripterygium regelii Sprague et Takeda）、昆明山海棠（Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.）。3者取其叶，在-80 ℃冰箱中保存，再于冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：DIKMA Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），洗脱梯度（0～12 min，38%A；12～25 min，38%～60%A；25～30 min，60%～65%A；30～35 min，65%A；35～48 min，65%～85%A；48～52 min，85%A；52～54 min，85%～83%A，54～65 min，83%A）；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：220 nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取雷公藤甲素对照品2.38 mg、雷公藤内酯酮对照品1.44 mg、雷酚新内酯1.53 mg、雷酚内酯1.67 mg，于2 mL容量瓶中，用50%DMSO甲醇溶液溶解，定容至刻度，摇匀即得，含雷公藤甲素对照品1 190 μg/mL、雷公藤内酯酮对照品720 μg/mL、雷芬新内酯对照品765 μg/mL、雷酚内酯对照品835 μg/mL、雷公藤红素对照品930 μg/mL的混合对照品溶液。进样10 μL。对照品色谱图见图1。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取昆明山海棠、雷公藤、东北雷公藤干燥叶片适量。取昆明山海棠、雷公藤样品于2 mL离心管中，混合球磨仪粉碎2 min，加入10倍量体积（w/v）80%甲醇水溶液，超聲提取2 h，摇匀，离心10 min（14 000 r/min），上清液离心5 min（14 000 r/min），上清液微孔滤膜（0.22 μm）滤过，即得；取东北雷公藤样品研成粉末于15 mL离心管中，加入10倍量体积（w/v）80%甲醇水溶液，超声提取2 h，抽滤，浓缩，用80%甲醇水溶液定容至2 mL，离心10 min（14 000 r/min），上清液离心5 min（14 000 r/min），上清液微孔滤膜（0.22 μm）滤过，即得。进样15 μL。

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品储备液适量，分别用50%DMSO甲醇溶液溶解逐渐稀释配制成5个不同浓度的混合对照品溶液，用“2.1项”下色谱条件进行分析。以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，进行回归，回归方程及线性关系。见表1。

2.5 样品测定结果 按2.3项下的制备方法制备供试溶液，按2.1项下的色谱条件进样，测定峰面积，计算含量。见表2。

2.6 统计学方法 采用SPSS统计学软件对雷公藤属3个物种化学成分含量数据进行统计学分析，结果显示，不同物种间雷公藤甲素、雷酚内酯和雷公藤红素含量，差异有统计学意义（P<0.05）；不同物种间雷公藤内酯酮和雷酚新内酯含量，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.7 聚类分析 以雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚新内酯、雷酚内酯和雷公藤红素五种化学指标作为聚类指标，以各产区样品各指标作为聚类数据，采用系统聚类法对不同样品进行聚类分析。见图3。

由图3可见，样品可被聚为四类，雷公藤74、雷公藤75、雷公藤76、雷公藤77被聚为一类，雷公藤68a、雷公藤78、雷公藤79、雷公藤80和雷公藤81被聚为一类，昆明山海棠1、雷公藤69、雷公藤70a、雷公藤72被聚为一类；东北雷公藤和昆明山海棠2、3、4、5被聚为另一类。可见，东北雷公藤样品可明显与雷公藤样品区分，2者萜类成分整体含量有较大差异；而昆明山海棠样品混在2者之间不能区分。此外，雷公藤样品不能聚为一类，说明不同雷公藤样品之间萜类成分含量有差异，样品质量的稳定性不如东北雷公藤。雷公藤74、75、76、77与东北雷公藤样品可聚为一大类，这可能与其所处海拔与采收时间有关，使其萜类含量与东北雷公藤接近。

3 讨论

3.1 提取方法及色谱条件的选择 本实验在选择提取方法时，参考了不同文献[9-12]，比较了浸提法、加热回流法、煎煮法和超声提取法，综合提取时间，提取效率考虑，最终选择了超声提取法。

在确定色谱条件时，参考了不同的文献[13-16]，比较了0.05%磷酸水溶液、0.05%乙酸水溶液、与0.05%磷酸水溶液相同pH值的乙酸水溶液作为流动相时的分离效果，比较了流速为1 mL/min和0.8 mL/min时的分离效果，实验结果显示，以0.05%磷酸水溶液为水相，流速为0.8 mL/min时，分离效果较好且基线相对平坦。

3.2 统计分析雷公藤属植物的差异 雷公藤属3个物种的萜类含量测定结果显示，雷公藤与昆明山海棠中的雷公藤甲素和雷公藤内酯酮含量，差异有统计学意义（P<0.05），而雷酚新内酯、雷酚内酯和雷公藤红素含量，差异无统计学意义（P>0.05）。雷公藤与东北雷公藤中的雷公藤甲素、雷酚内酯和雷公藤红素含量，差异有统计学意义（P<0.05），而雷公藤内酯酮和雷酚新内酯含量，差异无统计学意义（P>0.05）。东北雷公藤与昆明山海棠中的雷公藤甲素和雷酚内酯含量，差异有统计学意义（P<0.05），而雷公藤内酯酮、雷酚新内酯和雷公藤红素含量，差异无统计学意义（P>0.05）。3者比较，雷公藤、东北雷公藤和昆明山海棠中的雷公藤甲素、雷酚内酯和雷公藤红素含量，差异有统计学意义（P<0.05），而雷公藤内酯酮和雷酚新内酯含量，差异无统计学意义（P>0.05）。其中，雷公藤中雷公藤甲素、雷酚新内酯和雷公藤红素的含量在3者中最高；东北雷公藤中雷公藤内酯酮和雷酚内酯的含量在3者中最高，而雷公藤甲素的含量在3者中最低；昆明山海棠中雷公藤内酯酮、雷酚新内酯、雷酚内酯和雷公藤红素的含量在3者中均最低。

3.3 雷公藤属植物分类学争议 雷公藤属植物在分类学上一直存在争议。在《中国植物志》中，雷公藤属植物分为了雷公藤、东北雷公藤和昆明山海棠3个种。然而在随后出版的《中国植物志》中，雷公藤属植物的3个种均被命名为雷公藤。据文献报道[5]，从遗传分类角度分析，雷公藤与昆明山海棠之间存在大量的中间类型，使种间界限模糊，而东北雷公藤可作为一个独立的物种。有定量分析表明[13]，雷公藤和昆明山海棠中19种化合物的含量存在显著性差异。但是，对不同种群和个体的雷公藤属植物进行雷公藤甲素含量测定，发现东北雷公藤中雷公藤甲素含量很低，而雷公藤和昆明山海棠中雷公藤甲素含量，差异无统计学意义（P>0.05）[17]。此外，还有文献指出[4]，东北雷公藤和昆明山海棠中11个化学成分的含量，差异有统计学意义（P<0.0001）。本实验参照药用植物化学分类研究方法，基于萜类成分对样品进行系统聚类分析，通过系统聚类分析发现东北雷公藤与雷公藤可明显区分，2者化学亲缘关系较远，而昆明山海棠混在2者之间，与2者无明显区分。

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