海黄瓜共附生细菌多样性及其对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用

江蕾　李菲　李智　易湘茜　邓家刚　周桂　高程海

摘要：[目的]研究海黄瓜（Pseudocnus echinatus）共附生细菌多样性及其发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用，为甘蔗黑穗病的防治及新型生物农药的研发提供新途径。[方法]利用微生物纯培养技术分离纯化海黄瓜的表皮、肠、胃和肠内容物等组织的共附生细菌，并通过16S rDNA序列分析共附生细菌种类多样性及其在海黄瓜不同部位组织的分布特征；采用牛津杯法测定共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用。[结果]从海黄瓜各部位组织共分离得到79株共附生细菌，归属于4门26科35属46种；优势菌属为：芽孢杆菌属（Bacillus，16.5%）、鞘氨醇盒菌属（Sphin-gopyxis，8.9%）、小单孢菌属（Micromonospora，6.3%）和柠檬酸杆菌属（Citrobacter，6.3%）。分别以甘蔗鞭黑粉菌的“+”型担孢子、“-”型担孢子和菌丝为靶标，采用牛津杯法筛选得到19株活性菌，其中以芽孢杆菌属的BGMRC03005对甘蔗鞭黑粉菌菌丝、“+”型担孢子和“-”型担孢子的抑制作用最强，抑菌圈直径分别为25.40、19.90和14.25 mm。[结论]海黄瓜中可培养细菌种类丰富，且富含对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的菌株。筛选获得的芽孢杆菌属细菌BGM-RC03005对3种鞭黑粉菌形态均有抑制作用，具有开发成为微生物农药的潜力。

关键词：海黄瓜；海洋细菌；物种多样性；甘蔗鞭黑粉菌；抑菌活性

中图分类号：S435.661；Q939.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0488-07

0引言

[研究意义]甘蔗黑穗病是一种由甘蔗鞭黑粉菌（勋orisorium scitamineum）引起的全球性甘蔗病害（V（mky，1999），其传播速度快，发病时间短，一旦感染很难根除。鞭黑粉菌侵入甘蔗后，其冬孢子会黏附在幼芽的鳞片内部和新生叶的基部，并随着甘蔗的生长而快速传播（Su et a1.，2013），从而导致甘蔗产量和产糖量下降。因此，寻找对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的生防菌株，对于甘蔗黑穗病的防治有极其重要的意义。[前人研究进展]生物防治是植物病害防治中的重要组成部分，且越来越得到世界各国的重视，其中，芽孢杆菌因其生长速度快、抑菌作用广泛而成为科研工作者研究生防微生物的热点（齐爱勇等，2011）。廖咏梅等（2004）采用微生物纯培养法从不同甘蔗黑穗病样地采集的甘蔗根际土壤及其根、茎、叶等组织内分离获得928株菌株，并采用对峙培养法从中筛选得到18株对甘蔗鞭黑粉菌有较强拮抗作用的细菌菌株，其中有12株隶属于芽孢杆菌属。熊国如等（2013）利用对峙培养法测定对甘蔗鞭黑粉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的抑菌活性，结果显示抑菌圈直径大于10 mm，且该菌在盆栽防效试验中对甘蔗黑穗病也有很好的抑制效果。李菲等（2017）利用牛津杯法对来自红树植物秋茄的50株内生细菌进行抗甘蔗鞭黑粉菌活性测定，结果筛选得到37株抑制程度不同的活性菌株，其中有6株隶属于芽孢杆菌属。[本研究切入点]目前，植物病害生防菌主要是从植物不同部位或其根际土壤中分离获得，关于从海生动物中分离筛选得到植物病害生防细菌的研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]以海洋生物海黄瓜（Pseudocnus echinatus）为研究对象，采用微生物纯培养技术、1 6S rDNA序列分析及牛津杯法开展其共附生细菌多样性及细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用研究，为甘蔗黑穗病的防治及新型生物农药的研发提供新途径。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样本来源及预处理 海黄瓜于2016年10月采集自广西防城港怪石滩（东经108°22，北纬21°49）水下5 m。用无菌水冲洗海黄瓜表面3遍，分别从海黄瓜的表皮、肠、胃和肠内容物等4个部位切取1 cm×1cmdx块，分别加1 mL无菌水研磨，研磨液保存于无菌离心管，待用。

1.1.2主要试剂和仪器 培养基、TAE缓冲液、2×Easy Taq MasterMix、引物（27F和1492R）、DNA Mar-ker和GoldView核酸染料购自北京康为世纪生物科技有限公司，Chelex 100树脂购自美国伯乐公司，其他有机试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：SW-CJ-2F型洁净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司）、MINI-6k型迷你离心机（常州市国旺仪器制造有限公司）、T-gradient型多功能梯度PCR仪（德国Biometra公司）、Powerpac Basic型电泳仪（美国伯乐公司）、Carestream Gel Logic 2200 Pro冷CCD凝胶成像分析系统（美国锐珂公司）、VCX-500超声波细胞破碎仪（美国sonics公司）、N1000型旋转蒸发仪（日本EYELA株式会社）、VB一55型高压灭菌锅（德国SYSTEC公司）和MINIB-100型金属浴（杭州米欧仪器有限公司）。

1.1.3供试菌采集及保存 甘蔗鞭黑粉菌冬孢子于2017年5月采自广西金光农场的发病甘蔗植株，轻轻敲打新鲜黑穗病鞭子上的冬孢子，装于封口袋中，40℃烘干并保存于4℃冰箱备用。

1.2共附生细菌菌株的分离纯化

将海黄瓜不同部位组织研磨液分别梯度稀释至10-1、10。和10-3，将稀释液涂布至M1、M5、M7、M9、M10、AGG、Isp3和Isp7等8种分离培养基上，28℃恒温培养15 d，挑取不同形态单菌落劃线纯化，记录菌落数及其形态特征。用冻存管4℃保藏纯化后的菌株。

1.3共附生细菌的多样性分析

1.3.116S rDNA序列及系统发育分析 采用Che-lex-100树脂法（周双清等，2010）提取纯化后细菌的DNA，并参照Walsh等（1991）的方法进行16S rDNA序列的PCR扩增。扩增样品经1%琼脂糖凝胶电泳检验合格后，委托上海美吉生物医药科技有限公司广州分公司纯化并测序。测序结果经DNASTAR整理，利用EzTaxon Sever 2.1（http：Ilwww.eztaxon.org/）（Kim et a1.，2009）和BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线比对；选取同源性高的已知序列作为参比菌株，运用MEGA 5.0构建Neighbor-Joining系统发育进化树，并对各菌株的系统发育地位进行分析（Tamura et a1.，2011）。

1.3.216S rDNA序列聚类分析 参照Tap等（2009）的方法，通过Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制韦恩图，分析海黄瓜不同部位共附生细菌在属级水平上的分布特征。

1.4共附生细菌对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果试验

1.4.1细菌粗提物制备 参照覃媚等（2016）的方法，将分离获得的共附生细菌菌株分别接种于Isp2液体培养基中180 r/min、28℃发酵7 d，收集发酵液，用细胞破碎仪进行破碎、乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪浓缩，收集粗提物，置于干燥器中保存。

1.4.2甘蔗鞭黑粉菌担孢子及菌丝的制备 参照Singh等（2005）的方法，取少量鞭黑粉菌冬孢子与无菌水混匀，混匀后将原液稀释至10-1、10-2和10-3，并涂布于PDA培养基上，待其萌发后，选取生长效果最佳的单菌落（10。时生长效果最佳，最佳浓度选取依据为涂布后菌落呈单个分布，且稀疏程度适中）与1mL无菌水混匀，稀释至10^-5，取200μL涂布于PDA培养基，于28℃培养3-5 d。待其长出酵母形态菌落后，随机选取5个分别接种于YEPS液体培养基中，180 r/min、28 ℃培养24 h。各取1 uL菌液于PDA培养基上进行随机交叉配型，若菌落为白色绒毛状，则两菌株为异型（+、-）交配型单倍体担孢子；若菌落为酵母形态，则两菌株为同型交配型单倍体担孢子。

1.4.3抑制甘蔗鞭黑粉菌担孢子及菌丝生长的活性鉴定 参照宫小明等（2015）的牛津杯法分别检测各共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。利用生物级DMSO将共附生细菌发酵产物浓度调至10 mg/mL，分别挑取已验证的两种异型（+、-）单倍体担孢子接种于50 mL YEPS液体培养基中，置于28℃、180 r/min的摇床中培养36 h。参照李菲等（2017）的方法制备待试菌板。空白对照为DMSO，阳性对照为5μg/mL啶酰菌胺。每个牛津杯中加入100μL样液，置于28℃培养箱中培养，培养5 d后，利用垂直十字交叉法测量各抑菌圈的直径。

2结果与分析

2.1海黄瓜中可培养共附生细菌多样性分析结果

2.1.116S rDNA序列及系统发育分析 采用8种分离培养基从海黄瓜的表皮、肠、胃和肠内容物中分别分离获得25、26、8和20株共79株共附生细菌（表1），根据菌落的表观形态及出现时间排除相同菌株，经16S rDNA序列及系统发育分析发现，在种的分类水平上，79株共附生细菌可分为46个种，归属7：4门26科35属。从属级水平统计分离得到的细菌数，发现其优势菌属为：芽孢杆菌属（Bacillus，16.5%）、鞘氨醇盒菌属（Sphingopyxis，8.9%）、小单孢菌属（MicFomonospo-ra，6.3%）和柠檬酸杆菌属（Citroeacter，6.3%）。

根据46株共附生细菌的16S rDNA序列，选取同源性高的已知序列作为参比菌株，构建Neighbor-Joining系统发育進化树（图1）。如图1所示，46株共附生细菌与其参比菌株的同源性较高，均在90%以上（图中未展开表示的4株Bacillus sp.为BGMRC03002-BGMRC03005，其参比菌株分别为B.altitudinis、B.aryabhattai、B.indicus和B.siamen-sis；未展开表示的4株Pseudomonas sp.为BGM-RC03032-BGMRC03035，其参比菌株分别为P.ae-ruginosa、P.monteilii、P.oryzihabitans和P.stutzeri）。

2.1.2各培养基分离海黄瓜中可培养共附生细菌种类 利用8种分离培养基对海黄瓜不同部位中的共附生细菌进行分离纯化，结果（图2）显示，Isp7培养基分离得到的细菌种类最多，包括13属17种细菌；M7培养基分离得到的细菌种类最少，只有2属4种细菌。菌落计数结果表明，M1、M5、M7、M9、MIO、AGG、Isp3和Isp7培养基上的菌落数分别为2.5x 103、3.0× 10³、2.0×10³、2.5×10³、8.0×10³、7.0×10³、6.5×10³和8.5×10³CFU/mL。由此可见，Isp7培养基分离到的菌株数量及种类均最多，可作为海黄瓜共附生细菌的首选分离培养基。

2.1.316S rDNA序列聚类分析 在属的分类水平上对海黄瓜表皮、肠、胃和肠内容物来源细菌进行16S rDNA序列聚类分析（图3），结果发现海黄瓜不同部位共附生细菌种类差异较明显，从海黄瓜表皮、肠、胃和肠内容物部位中分别获得18、18、5和15个菌属；海黄瓜的4个部位中均分离到芽孢杆菌属细菌、柠檬酸杆菌属、甲基杆菌属（Methylobacterium）和鞘氨醇盒菌属的细菌，表皮、肠和肠内容物中均分离到分枝杆菌属（Mycobacterium）和假单胞菌属（Pseudo-monas）细菌，肠和肠内容物中均分离到色盐杆菌属（Chromohalobacter）、Fictibacillus属和小单孢菌属（Micromonospora）细菌，表皮和肠中均分离到海杆菌属（Marinobacter）细菌，表皮和肠内容物中均分离到海旋菌属（Thalassospira）细菌。

2.2海黄瓜共附生细菌发酵物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果

分别以甘蔗鞭黑粉菌的“+”型担孢子、“-”型担孢子和菌丝为靶标，采用牛津杯法从46株细菌中筛选得到8株对鞭黑粉菌菌丝生长有抑制作用的细菌，阳性率为17.4%；9株细菌对鞭黑粉菌“+”型担孢子有抑制作用，阳性率为19.6%；7株细菌对鞭黑粉菌“-”型担孢子有抑制作用，阳性率为15.2%（图4和表2）。46株细菌中有19株对甘蔗鞭黑粉菌至少一种形态有抑制作用，总阳性率为41.3%，其中芽孢杆菌属细菌3株，假单胞菌属细菌2株；在所有活性菌株中，只有细菌BGMRC03005对3种鞭黑粉菌均有抑制作用，且抑制作用最强，抑制甘蔗鞭黑粉菌菌丝、“+”型担孢子和“-”型担孢子的抑菌圈直径分别为25.40、19.90和14.25 mm，其中抑制甘蔗鞭黑粉菌菌丝和“+”型担孢子的抑菌圈直径超过阳性对照，具有开发成为微生物农药的潜力。

3讨论

海洋微生物是一种潜在的微生物资源，代谢产物丰富。广西防城港海域生态环境多样，海产资源丰富，其中富含多种多样的微生物资源，且活性菌株较多。本研究利用8种成分各异的培养基从广西防城港怪石滩海域海黄瓜的表皮、胃、肠及肠内容物中分离获得共附生细菌79株，隶属于4门26科35属46种，根据培养基分离出的细菌种类及数量，确定Isp7培养基为最优分离培养基。共附生细菌在海黄瓜各部位的种类与数量分布不一，其中从肠中分离得到的细菌种类和数量最多，其次是表皮，胃中最少。海黄瓜中共附生细菌主要分布在肠和表皮上，可能与海黄瓜表皮暴露在海水中，海水中的细菌会附着或寄生在其表皮上，同时海黄瓜在摄食中食物所携带的细菌可能会附着或寄生在肠中有关。

本研究采用牛津杯法从46株共附生细菌中筛选得到19株对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的细菌，总阳性率为41.3%，其中，芽孢杆菌属细菌BGMRC03005对3种鞭黑粉菌形态均有抑制作用，与廖咏梅等（2004）、李菲等（2017）的研究结果相似。芽孢杆菌属为植物病害生物防治中应用最广泛且取得成功的一种高效生防微生物（蒋琳和马承铸，2000；徐滔明等，2016）。本研究測试了4株分离白海黄瓜的芽孢杆菌（BGMRC03002～BGMRC03005）对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果，结果显示有3株芽孢杆菌具有抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性，但只有BGMRC03005具有同时抑制3种鞭黑粉菌形态的活性，其余两株都仅对某一种形态的甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用。说明并非所有芽孢杆菌属的菌株均对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用，且不同种之间抑制效果也不相同，造成不同抑制效果的原因可能与不同种类芽孢杆菌的代谢途径不同有关，不同的代谢途径可能产生不同结构或活性差异明显的代谢产物。因此，在后续的研究中还需针对活性菌株发酵产物作进一步研究，包括发酵产物中化学成分分析、活性菌株合成活性产物的途径及活性产物的作用机理等。

4结论

本研究采用8种分离培养基对广西防城港怪石滩海域海黄瓜的表皮、胃、肠和肠内容物进行共附生细菌分离及鉴定，结果共分离获得共附生细菌79株，归属于4门26科35属46个种，并从中筛选得到19株对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的细菌，表明海黄瓜中可培养细菌种类丰富，且富含对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的菌株，其中芽孢杆菌属细菌BGMRC03005对3种鞭黑粉菌形态均有抑制作用，具有开发成为微生物农药的潜力。

（责任编辑 麻小燕）