甜瓜尾孢叶斑病病原分离与鉴定

叶云峰　杜婵娟　覃斯华　柳唐镜　洪日新　付岗　李桂芬　黄金艳

摘要：[目的]明确近年来引起广西大棚厚皮甜瓜叶斑病的病原，为该病害的有效防治提供参考依据。[方法]采用单孢分离法直接从罹病厚皮甜瓜叶片上分离病原菌，以离体叶片接种法验证病原菌的致病性。对致病菌的菌落、产孢结构、分生孢子等形态特征进行观察，同时对致病菌的rDNA-ITS基因序列进行同源性比对分析。[结果]病原菌形态特征与瓜类尾孢（Cercospora citrullina）基本一致，rDNA-ITS基因序列与瓜类尾孢的同源性达99%。结合病原菌的形态学和分子生物学特征，将该病害的病原菌鉴定为瓜类尾孢。[结论]近年在广西大棚厚皮甜瓜产区严重发生的甜瓜叶斑病由瓜类尾孢引起，该病是广西厚皮甜瓜上的一种新病害。

关键词：甜瓜；叶斑病；病原鉴定；瓜类尾孢

中图分类号：S436.5 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0476-05

0引言

[研究意义]甜瓜是葫芦科黄瓜属（CucumisLinn.）一年生蔓生草本植物，分为薄皮甜瓜和厚皮甜瓜两大类型。厚皮甜瓜（包括哈密瓜、白兰瓜和粗皮甜瓜等）原产非洲和亚洲热带地区，我国新疆为厚皮甜瓜次生起源中心之一。广西引进厚皮甜瓜种植始于20世纪90年代中期，并于1998年开始通过改用大棚保护地避雨栽培試种获得成功，2003年后种植面积迅速扩大，常年种植总面积约4000 ha，种植甜瓜已成为广西部分瓜农脱贫致富的重要途径。由于广西的气候高温多雨，大棚内湿度大，加上大棚栽培难以实施轮作，致使大棚甜瓜生产受到多种病害的威胁。本课题组于2015-2016年在广西南宁、北海和钦州等厚皮甜瓜主产区开展甜瓜病害种类调查时发现一种叶部新病害，该病害侵染北甜一号、好运11号和新金凤凰等厚皮甜瓜品种，其症状与以往发生的甜瓜叶部病害症状存在明显差异，主要表现为在叶片上形成近圆形或倒“V”字形褐色大型病斑。该病在春茬甜瓜上的发病率为30%～50%，在秋茬甜瓜上发生更严重，多数大棚发病率在80%～22z，严重的发病率达100%，成为2015～2016年广西大棚甜瓜最严重的叶部病害之一。该病主要造成甜瓜叶片大面积枯死，植株早衰，严重影响果实后期的营养吸收，降低果实品质和产量，造成20%～40%的经济损失。目前该病病原菌的分类地位尚不明确，因此，开展该病原的鉴定研究，对有效防治该病害具有重要的指导意义。[前人研究进展]在我国南方地区大棚甜瓜上常发生的病害主要有霜霉病、白粉病、蔓枯病、病毒病、枯萎病、炭疽病、猝倒病和根结线虫病等（何毅等，2005；周灵芝等，2006）。经比对，本课题组调查发现的甜瓜叶部新病害症状与上述常见病害的叶部症状存在明显差异，关于这种新病害目前未见相关研究报道。此外，前人对植物病害的鉴定通常采用病原菌形态学和分子生物学相结合的方法，该方法能将病原菌鉴定到种的水平（王爽等，2013；冉双飞等，2016；赵杨等，2016；欧阳秋飞等，2017）。[本研究切入点]对于一种新发生的病害，准确鉴定其病原菌是进行有效防治的基本前提。目前对近年来广西大棚甜瓜叶片上发生的新病害尚无文献报道。[拟解决的关键问题]采用单孢分离法对厚皮甜瓜上新发生的叶部病害进行病原菌分离，用离体叶片接种法进行致病性测定，同时对病原菌的形态特征进行显微观察，并对其rDNA-ITS基因序列进行同源性比对分析，结合病原菌的形态学特征和分子生物学分析结果进行鉴定，以明确该病原菌的分类地位，为该病害的有效防治提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

病原菌分离和接种均采用厚皮甜瓜品种好运11号，种植于广西南宁市武鸣区锣圩镇武帽农场。病原菌分离采用马铃薯琼脂培养基（PDA）。

1.2病害症状观察

2015年8月～2016年12月，在南宁市武鸣区、青秀区和北海市银海区等厚皮甜瓜主产区，于不同发病时期对厚皮甜瓜叶斑病进行症状观察、记录和拍照。

1.3病原菌鉴定

1.3.1病原菌分离 从南宁市武鸣区锣圩镇武帽农场5个大棚采集新鲜病叶各1张，分别用灭菌水冲洗表面，置于28℃下保湿2 d，在超净工作台上进行病原菌单孢分离。用沾了无菌水的灭菌接种环粘取病斑处的分生孢子，在水琼脂块表面划线，置显微镜下观察，挑取单孢子移入另一块水琼脂块表面，再次用显微镜观察，确认第2块水琼脂块上只含有1个分生孢子，将第2块水琼脂块移到PDA培养基上，28℃下黑暗培养10 d，挑取菌落边缘的菌丝块转接至PDA斜面培养基上，培养10 d后4℃保存备用。

1.3.2病原菌致病性测定 从生长健壮的甜瓜植株中上部剪取健康叶片，用无菌水冲洗干净。用灭菌接种针在健康叶片上的每个接种点针刺5下，在伤口处滴半滴无菌水。从28℃黑暗培养15 d的菌落上切取菌丝块（5 mm×5mm），将长菌丝的一面贴于针刺伤口处。每处理3张叶片，每张叶片接种3个菌丝块；以针刺伤口处贴放PDA空白培养基块为对照。将处理和对照叶片置于28℃下保湿培养，定期观察各处理叶片的发病情况。发病后对病斑上的病原菌进行再分离，比较分离菌株与接种菌株的菌落和分生孢子形态是否相同，如分离菌株与接种菌株的菌落和分生孢子形态相同，则说明是同一种真菌，可确认为病原菌。

1.3.3病原菌形态学鉴定 将致病菌接种到PDA培养基上，置于28℃下黑暗培养，定期观察记录菌落的形态特征和生长情况。另外，用灭菌解剖刀片从叶片病斑上刮下菌体，置于载玻片上的半滴无菌水中，盖上盖玻片，置显微镜下观察病菌的产孢结构和分生孢子形态特征，并测量大小。

1.3.4病原菌分子生物学鉴定 采用天根生化科技（北京）有限公司生产的DNA提取试剂盒提取病原菌基因组DNA。以真菌通用引物ITS1（5-TCCG-TAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）（朱迎迎等，2016）对病原菌的rDNA-ITS序列进行PCR扩增。PCR反应体系25.0 uL：2.5 mmol/L dNTP 2.0μL，10xBuffer 2.5μL，5 U/IaLEx Taq 0.5 μL，10 μmol/L ITS1和ITS4各1.0μL，模板DNA 100 ng，超纯水补足至25.0μL。扩增程序：95℃预变性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃80 s，进行35个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目标DNA条带，送交金唯智生物科技（北京）有限公司进行序列测定。运用BLAST将测序结果与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比对分析。

2结果与分析

2.1病害症状

该病害在厚皮甜瓜定植后的整个生育期均可发生，苗期发生较轻微，以生长中后期（结果期至采收期）发病最重。病害症状首先在植株下部的叶片上出现，随后向中上部叶片扩展。初期在叶片上形成灰白色圆形小斑点，后逐渐扩大成近圆形褐色病斑，病斑中央常为灰白色，外围有明显黄色晕圈（图1-A）。还可形成不规则形或沿着叶缘叶脉向叶片内部扩展呈倒“V”字形的大型病斑，病斑均为褐色，外围有黄色晕圈（图1-B），病斑大小差异较明显。病害严重时，多个病斑融合在一起，致叶片大面积干枯死亡，造成植株早衰。

2.2病原菌分离和鉴定结果

2.2.1病原菌分离和致病性测定结果 对5张来自不同大棚的甜瓜病叶进行病原菌单孢分离，分离纯化得到形态特征一致的真菌5株。通过针刺接种法将5株菌株的菌丝块接种到健康的甜瓜叶片上，接种4 d后，接种部位均出现明显的近圆形褐色小病斑，直径8-10 mm，外围有明显黄色晕圈（图2-B）。隨着时间推移，病斑不断扩大，接种6 d后，病斑直径达25-30 inn3，病斑症状与自然发病的近圆形病斑症状相似（图2-C）。对照叶片未发病（图2-A）。从发病组织上采用单孢分离法再分离得到的菌株，其菌落和分生孢子形态与接种菌株相同，表明再分离获得的真菌菌株即为病原菌。选取其中一株菌株TBD-2进行培养菌落的形态特征观察和分子生物学鉴定。

2.2.2病原菌形态学鉴定结果 人工培养的菌落在PDA培养基上生长缓慢，28℃下黑暗培养10 d，菌落直径仅为3.0-3.5 cm，且不产生分生孢子。菌落近圆形，边缘平滑，气生菌丝致密，菌落正面为白色，中央隆起（图3-D），菌落背面黑褐色，产生红色色素。菌落生长特征基本与尾孢属真菌相符（雷玉明和张建文，2006）。

从叶片病斑上观察到病菌子实体叶两面生。刮下菌体制成临时玻片在显微镜下观察，可见子座小或不明显。分生孢子梗单生或2-12根簇生，顶部浅褐色，基部深褐色，不分枝，直立或弯曲，有1-7个曲膝状折点，1-8个隔膜，顶部圆锥形平截，孢痕疤明显加厚（图3-C），大小为（52.5-245.0）μm×（4.0-6.0）gin。分生孢子针形，直或稍弯曲，无色，单生，基部平截，顶端渐细至钝，多个隔膜（图3-A和图3-B），大小为（48.5-238.0）μmx（2.7-5.4）岬。从叶片病斑上观察到的病原菌形态特征与《中国真菌志》第二十四卷尾孢菌属（郭英兰等，2005）描述的寄生在葫芦科作物上的瓜类尾孢（Cercospora citrullina）基本一致。

2.2.3病原菌分子生物学鉴定结果 用真菌通用引物ITSl和ITS4对菌株TBD一2的rDNA-ITS基因进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得长度约530 bp的DNA片段（图4）。回收该DNA片段进行测序，得到538 bp的基因序列（GenBank登录号KY824771），将该序列与GenBank数据库中已公布的基因序列进行BLAST同源比对分析，结果表明，该序列与瓜类尾孢的同源性达99%。

结合病原菌的形态学和分子生物学鉴定结果，将菌株TBD-2鉴定为瓜类尾孢（C.citrullina）。

3讨论

国内外已报道能引起甜瓜叶斑病的病原菌有多种，包括瓜链格孢（Alternaria cucumerina）（Egeland Harmon，2007）、交链格孢（A.alternata）（Zhouand Everts，2008；Huang et a1.，2011）、多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）（王爽等，2013）和丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）（李亚利等，2007）等真菌和细菌，由瓜类尾孢（C. citrullina）引起的甜瓜叶斑病未见相关文献报道。瓜类尾孢主要侵染葫芦科的冬瓜、西瓜、南瓜、西葫芦、黄瓜、丝瓜和苦瓜等作物（郭英兰等，2005），引起叶斑类病害。鉴于能引起甜瓜叶斑病的病原种类较多，为避免混淆，建议将瓜类尾孢引起的甜瓜叶斑病定名为甜瓜尾孢叶斑病。

本研究发现采用常规的组织分离法很难分离到尾孢菌，其原因可能是尾孢菌在人工培养基上生长缓慢，容易被其他生长较快的腐生真菌或内生真菌覆盖，因此采用组织分离法通常分离到其他真菌而不是尾孢菌。而采用挑取单孢的分离法，可有效分离到纯的尾孢菌，且能减少病菌分离纯化的工作量。刘庆奎等（2013）、张小飞等（2014）也是采用单孢分离法对尾孢属真菌进行分离。

瓜类尾孢在人工培养基上生长缓慢，这一特性与其他尾孢属真菌相同（雷玉明和张建文，2006）。其生长缓慢的特性将影响后续的生物学特性测定、药剂敏感性测定等室内试验的开展，因此，促进该病原菌快速生长的培养条件和培养方法尚需进一步探究。

4结论

结合形态学和分子生物学方法，对近年来在广西大棚厚皮甜瓜上严重发生的一种叶部新病害进行鉴定，将病原菌鉴定为瓜类尾孢（C. citrullina），该病是广西厚皮甜瓜上的一种新病害。

（责任编辑 麻小燕）