桑叶槲皮素提取物抗氧化活性研究

王海燕 杨金龙 谷山林 王小燕 王介平 周婵 吕金凤 曾秀

摘要： 桑叶是药食两用植物资源，桑叶槲皮素是其主要的黄酮類化合物，具有广泛生理活性。为了更深入研究桑叶槲皮素活性作用，文章对桑叶槲皮素抗氧化性展开研究，采用大孔树脂法对桑叶槲皮素提取物进行纯化，并对其抗氧化活性进行研究。结果表明：在还原力、清除DPPH方面桑叶槲皮素纯化物较槲皮素粗提取作用较好；在清除超氧阴离子作用方面，低浓度时粗提物优于纯化物，高浓度时纯化物优于粗提物；在清除羟基自由基作用时，粗提物则表现比纯化物较强的清除作用。

关键词： 桑叶；大孔树脂法；槲皮素；抗氧化性；抗坏血酸

中图分类号： TS195.644文献标志码： A文章编号： 1001-7003（2018）03-0015-06引用页码： 031103

Abstract： The mulberry leaf is a kind of medicinal and edible plant leaves. Quercetin is the main flavonoids in mulberry leaves， with a wide range of physiological activity. In order to study the activity of quercetin in mulberry leaves， this paper studies the antioxidant activity of quercetin in mulberry leaves. The quercetin extract from mulberry leaves was purified by macroporous resin method， and its antioxidant activity was studied. The results showed that the crude extract of mulberry leaf quercetin was less than purified product in reducing power and eliminating the DPPH； and the crude extract was superior to the purified product in the removal of superoxide anion when the concertration is low， high concentration of the purification was better than the crude extract； in the removal of hydroxyl radicals， the crude extract was better than the purification of the role of purification.

Key words： mulberry leaves； macroporous resin method； quercetin； antioxidant activity； ascorbic acid

中国是栽桑大国，拥有丰富的桑叶资源，随着养蚕业的缩减，大量桑园处于荒废状态，造成桑叶的浪费，多元化利用桑叶资源对稳定蚕桑产业具有重要作用。桑叶因其含有丰富的黄酮、生物碱、多糖等活性成分[1-2]，在降血糖、降血脂、抗衰老、预防心脑血管疾病、提高免疫力等方面呈现较好作用[3-10]。研究显示，桑叶所具有的功能作用与黄酮类活性物质的抗氧化性关系密切[11-15]。槲皮素是桑叶中主要黄酮醇化合物，抗氧化活性较强，大量文献报道槲皮素抗肿瘤、抑制血小板凝结、抗粥样动脉硬化、抑制胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌转移等方面效果显著[16-19]。深入开发桑叶槲皮素活性成分资源，对天然药物的开发和桑叶资源的高效利用具有重要意义。

目前关于桑叶槲皮素的研究主要集中在检测方法的研究[20-21]，槲皮素的分离纯化及抗氧化活性测定方面报道较少。因此，本研究采用大孔树脂法进一步对桑叶粗提物进行分离纯化，以提高槲皮素的含量，并比较其抗氧化活性，为桑叶槲皮素的进一步开发利用提供可靠依据。

1材料与设备

1.1材料与试剂

桑叶（重庆市畜牧科学院蚕业研究所），槲皮素标准品（中国食品药品检定研究院），DPPH（东京化成工业株式会社），AB-8大孔树脂（南开大学），色谱纯甲醇（天津四友试剂有限公司）；分析纯无水乙醇、磷酸氢二钠、氯化钠、三氯乙酸、三羟基甲基氨基甲烷等（成都市科龙化工试剂厂）。

1.2仪器与设备

FA2004 B电子天平（上海越平科学仪器有限公司），XMTD-4000电热数显恒温水槽（上海比朗仪器有限公司），THC-10B数控超声波提取机（济宁天华超声电子仪器有限公司），SHZ-DⅢ循环水式真空泵、RE-2000B旋转蒸发器（巩义市予华仪器有限责任公司），TU-1901双光束紫外可见分光光度计（普析通用仪器有限责任公司），Agilent1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）。

2试验方法

2.1桑叶槲皮素粗提物制备方法

称取5g桑叶（60目）置于250mL提取瓶内，加入50%乙醇12.5mL，放入超声波提取器，在70℃下，超声功率200W、提取0.5h。超声波提取2次，抽滤，合并滤液，真空减压浓缩，回收乙醇，定容至50mL，获得桑叶槲皮素粗提物样品，备用[22]。

2.2桑叶槲皮素检测方法

色谱条件：高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）。检测条件：色谱柱为Alltima C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇和0.2%磷酸（体积比65︰35）；检测器紫外波长360nm；进样量10μL；流速1.0mL/min；柱温25℃。

2.3桑叶槲皮素纯化方法

以95%乙醇浸AB-8大孔树脂24h，再用95%乙醇淋洗，大量去离子水洗去乙醇；将AB-8大孔树脂装入层析柱（3cm×30cm），5%HCl溶液浸泡4h，用去离子水洗至中性；5%NaOH溶液进行碱处理，去离子水洗至中性，备用。将桑叶槲皮素粗提取物稀释成质量浓度为1.28mg/mL，加入至预处理好的AB-8大孔树脂层析柱中，上样体积100mL，过滤，收集流出液；再加入100mL60%乙醇洗脱液洗脱，洗脱流速为1mL/min，收集流出液，浓缩至干，备用[23]。

2.4抗氧化性测定

2.4.1还原力的测定

将桑叶槲皮素粗提物、纯化物、抗坏血酸、槲皮素标准品配成质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液。取2.5mL样液加入到2.5mL、pH 6.6的磷酸盐缓冲液中，再加入1%的铁氰化钾溶液2.5mL，混合，在50℃水浴锅中恒温20min，再加入2.5mL、10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min离心10min，取上清液5.0mL，并加去离子水5.0mL和0.1% FeCl3溶液1.0mL，在700nm处测定吸光度。平行试验重复3次，同时进行空白试验。

2.4.2抑制超氧阴离子（O-2·）活性试验

将桑叶槲皮素粗提物、纯化物、抗坏血酸、槲皮素标准品配成质量浓度分别为2、4、6、8、10mg/mL的溶液。将4.5mL、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液于25℃水浴预热20min，分别加入1.0mL不同质量浓度的样液和0.4mL、25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀，25℃水浴反应4min，立即加入0.5mL、8mol/L的HCl终止反应，320nm處测定吸光值，平行试验重复3次。空白对照组以相同体积的去离子水代替。清除率计算公式为：

式中：A0为空白液的吸光度值；A1为样液未加邻苯三酚的吸光度值；A2为样液加邻苯三酚的吸光度值。

2.4.3清除羟自由基（·OH）活性试验

将槲皮素粗提物、纯化物、抗坏血酸、槲皮素标准品配成质量浓度分别为2、4、6、8、10mg/mL的溶液。取6.0mmol/L的FeSO4溶液、6.0mmol/L的水杨酸-乙醇溶液各2.0mL于试管中，加入样液2.0mL，再加入6.0mmol/L的H2O2溶液2.0mL，混匀，放置10min后于510nm处测定吸光值。平行试验重复3次，同时以去离子水做空白试验。清除率计算公式为：

式中：A0为空白液的吸光度值；A1为样液未加H2O2的吸光度值；A2为样液加H2O2的吸光度值。

2.4.4清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）作用

将槲皮素粗提物、纯化物、抗坏血酸、槲皮素标准品配成质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液。分别取3.0mL不同质量浓度的样液于试管中，加入3.0mL、20 μg/L的DPPH·溶液，摇匀，放置30min后于517nm处测定其吸光度A2。同时测定3.0mL样液与3.0mL溶剂混合后的吸光度A1，3.0mL溶剂与3.0mL、20μg/L的DPPH·溶液混合后的吸光度A0。平行试验重复3次。清除率计算公式为：

式中：A0为溶剂与DPPH·溶液混合后的吸光度值，A1为待测液与溶剂混合后的吸光度值，A2为待测液与DPPH·溶液混合后的吸光度值。3结果与分析

3.1桑叶槲皮素含量测定

桑叶槲皮素粗提物和纯化物的样品利用高效液相色谱测定，主要成分是槲皮素、绿原酸、芦丁、槲皮苷、山奈酚。桑叶槲皮素标准品和桑叶槲皮素纯化物高效液相色谱图见图1、图2。槲皮素标准曲线方程式：y=608.5x-626.3，R2=0.999。

在关于桑叶槲皮素研究报道中，戴开金等[20]对测定桑叶槲皮素最高含量为0.731mg/g。徐艳阳等[24]通过荧光法测定桑叶槲皮素含量为（41.92±0.11）mg/g。蒋立娣等[25]对经酸处理后桑叶提取物中槲皮素的含量为6%。本研究通过对桑叶槲皮素粗提物进行大孔树脂纯化、浓缩，槲皮素含量显著提高，由粗提物中（12.03±0.95）mg/g提高到（548.92±10.23）mg/g。

3.2还原力的测定

抗氧化剂清除自由基的机制主要因其具有较强的给电子能力，使不稳定的自由基的未成对电子成对，从而失去反应力。一般来说抗氧化剂的还原力越大，抗氧化的能力也就越强。还原能力越强，在波长为700nm下吸光值就越高。由图3可知，桑叶槲皮素粗提物、纯化物、抗坏血酸、槲皮素标准品均具有还原能力，还原力由大到小顺序：抗坏血酸>槲皮素标准品>桑叶槲皮素纯化物>桑叶槲皮素粗提物。在0.2～1mg/mL内，随着提取液质量浓度的增加，粗提物、纯化物、抗坏血酸的还原力逐渐增大，呈现明显的量效关系。在0.2～0.4mg/mL内，槲皮素纯化物的还原力增加迅速，随后增加缓慢。在试验浓度范围内抗坏血酸还原力增长趋于平稳。槲皮素标准品随着质量浓度的增加，呈现先增加（在0.8mg/mL时达到最大），随后有所降低。

3.3抑制超氧阴离子（O-2·）活性试验

由图4可知，桑叶槲皮素粗提物、纯化物、抗坏血酸、槲皮素标准品均对超氧阴离子具有较强的清除作用。对超氧阴离子清除作用由大到小顺序为：在2～6mg/mL时，桑叶槲皮素粗提物>桑叶槲皮素纯化物>槲皮素标准品>抗坏血酸；在6～10mg/mL时，桑叶槲皮素纯化物>槲皮素标准品>桑叶槲皮素粗提物>抗坏血酸。当质量浓度为2～6mg/mL时，各样品间的清除作用大小为：桑叶槲皮素粗提物>桑叶槲皮素纯化物>槲皮素标准品>抗坏血酸；在质量浓度为6～8mg/mL时，桑叶槲皮素纯化物和槲皮素标准品急剧增加，但是桑叶槲皮素粗提物呈下降趋势；在质量浓度为8～10mg/mL时，抗坏血酸的清除率仍呈现急剧增加，桑叶槲皮素纯化物和槲皮素标准品增加呈缓慢趋势，但是桑叶槲皮素粗提物由降转为增加趋势。

3.4清除羟自由基（·OH）活性试验

在当前所知的活性氧中，羟自由基对生物体毒性最强和危害最大。它可通过电子转移、加成和脱氢等方式和生物体内的多种分子反应作用，造成大分子物质的氧化性损伤，细胞坏死或者突变。由图5可知，各样品对羟基自由基都有一定的清除作用。在质量浓度为2～10mg/mL时，桑叶槲皮素粗提物、桑叶槲皮素纯化物、抗坏血酸、槲皮素标准品清除羟自由基的作用均呈现缓慢增加，各样品清除羟自由基作用由大到小的顺序为：抗坏血酸>槲皮素标准品>桑叶槲皮素粗提物>桑叶槲皮素纯化物。与牛天羽[26]研究表明的桑叶黄酮提取物抗氧化活性低于抗坏血酸一致。

3.5清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）作用

DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）是一种稳定的有机自由基，抗氧化剂的作用主要是使DPPH的单电子被配对而呈现颜色变浅现象，且其颜色变浅的程度和配对电子数成化学计量的关系。由图6可知，各样品的桑叶槲皮素对DPPH自由基都有一定的清除作用。在0.2～1.0mg/mL均呈现随着质量浓度的增加对DPPH自由基的清除能力缓慢增加，清除作用由大到小为：抗坏血酸>槲皮素标准品>桑叶槲皮素纯化物>桑叶槲皮素粗提物。与陈柳萌[27]研究发现的DPPH清除率与黄酮类成分含量成正相关结果一致。

4结论

本研究通过对桑叶槲皮素粗提物进行大孔树脂纯化、浓缩，槲皮素含量显著提高。根据各样品抗氧化活性测定结果可知，桑叶粗提物和纯化物抗氧化活性的高低与槲皮素含量具有较大相关性。在还原力、清除DPPH方面桑叶槲皮素纯化物较粗提物效果较好。在清除超氧阴离子作用方面，在2～6mg/mL浓度范围时，粗提物优于纯化物，在6～10mg/mL浓度范围时，纯化物优于粗提物；在清除羟基自由基作用方面，桑叶槲皮素粗提物优于纯化物。与抗坏血酸、槲皮素标准品比较，桑叶槲皮素粗提物和纯化物在还原力、清除羟自由基、清除DPPH方面作用均低于两种标准品。而在清除超氧阴离子作用时桑叶提取物却呈现较好的效果，分析认为是桑叶提取物中含有的其他活性物质协同作用清除了超氧阴离子自由基，有待后续进一步研究。

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