冰核细菌分离鉴定及拮抗菌筛选

赵晨心 丁海霞 彭丽娟

摘要 为了解贵州植物上冰核细菌的种类及分布，采用平板稀释法分离细菌和拮抗菌、小液滴冻结法鉴定冰核细菌、双层平板法筛选拮抗菌，通过形态学特征、生理生化指标结合16S rDNA序列对比分析等方法鉴定冰核细菌和拮抗菌的种类。结果表明，从贵州59种霜冻植物上分离到7株冰核细菌，从32份土壤中筛选到3株拮抗菌。经鉴定，7株冰核细菌中，1株为成团泛菌（Pantoea agglomerans），1株为菠萝泛菌（Pantoea ananatis），1株为荧光假单胞（Pseudomonas fluorescens），2株为丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae），2株为绿黄假单胞菌（Pseudomonas viridiflava）。3株拮抗菌中，1株放线菌为暗产色链霉菌（Strepto-myces phaeochromogenes），2株细菌均为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

关键词 冰核细菌；拮抗菌；鉴定；生物防治

中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：2095-3305（2018）04-059-06

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.04.024

Abstract Seven strains that identified as ice nucleation active bacteria by droplet freezing method were isolated from 59 kinds of frost plants in Guizhou Province. Three strains of antagonistic bacteria were screened from 32 soil samples by double-layer plate method. The species of ice nucleation active bacteria and antagonistic bacteria were identified by morphological characteristics， physiological and biochemical indicators combined with 16S rDNA sequence comparative analysis methods. It was identified that among the seven strains， one was Pantoea agglomerans， one was Pantoea ananatis， one was Pseudomonas fluorescens， two were Pseudomonas syringae and two were Pseudomonas viridiflava. Among the three antagonistic bacteria， one actinomycete was Streptomyces phaeochromogenes， and both bacteria were Bacillus amyloliquefaciens. Through this study， the species and distribution of ice nucleation on some plants in Guizhou Province were preliminary understood.

Key words Ice nucleation active bacteria； Antagonistic bacteria； Identification； Biological control

霜凍能在几小时内毁掉大片农作物， 是一种严重的自然灾害[1]，给农业生产造成巨大的经济损失。自1974年Maki等[2]首次从赤杨[Alnus japonica （Thunb.） Steud.]树叶中分离到冰核细菌（Ice nucleation active bacteria，INA细菌）以来，冰核细菌引起了国内外研究者的广泛关注，深入研究了冰核细菌种类、影响成冰活性因素和冰核细菌分子生物学特性[3]等方面的内容。冰核细菌广泛腐生于植物表面，可在-5～-2℃时诱发植物细胞水结冰而发生霜冻[4]。国内外大量研究证明[5-9]冰核细菌是破坏植物的过冷却状态，诱发和加重植物霜冻的重要因素[10-12]。

贵州位于云贵高原东侧，地处中低纬度地区，属亚热带季风湿润型气候，对于农业生产而言，既有丰富多样的立体气候资源，也有多发的气象灾害[13]。霜冻对贵州省农业发展造成了很大影响。如2005年发生在铜仁市、黔东南州部分县市的低温冷冻灾害，其中万山出现了历史罕见的雪凝天气，农作物受灾严重[14]。笔者从贵州4个市、州采集发生霜冻的植物组织分离冰核细菌，初步了解贵州植物上冰核细菌的种类及分布情况，并从土壤中分离细菌和放线菌，筛选拮抗冰核细菌的拮抗菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本采集 2014年12月至2015 年的3月，以及2015年12月至2016年的3月，从贵州省贵阳市、六盘水市、黔西南州、铜仁市等4个市、州的12个地点采集了59种霜冻植物标本（表1），于4℃的冰箱中保存备用。

1.1.2 土样采集 从贵州省贵阳市和六盘水市8个地点采集了32份土样（表2），用以分离拮抗菌。分离放线菌的土样在通风处晾干。

1.2 冰核细菌与拮抗菌分离

参考Goto等方法分离冰核细菌[15]。参考崔汝强等方法分离拮抗细菌[16]，采用稀释平板法分离拮抗细菌和放线菌[17]。

1.3 冰核活性的测定

采用Vali发明[18]，由Lindow[8]改进的小液滴冻结法测定冰核活性。

1.4 筛选冰核细菌拮抗菌

采用双层平板打孔法[19]筛选冰核细菌的拮抗细菌和放线菌，十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.5 鉴定方法

1.5.1 形态与生理生化鉴定 冰核细菌和拮抗细菌鉴定主要参考《常见细菌系统鉴定手册》[20]和《伯杰细菌鉴定手册（第八版）》[21]进行。放线菌鉴定参考《放线菌的分类与鉴定》进行[22]。

1.5.2 分子鉴定 刮取培养物，参考Bacterial gDNA kit试剂盒（Biomiga，GD2411-01）的步骤提取DNA，采用通用引物27F和1492R、gyrA-F和gyrA-R（引物序列见表3）[23]，扩增后采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行验证，确定条带正确后，将目的片段纯化回收，并与pMD19-T 载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上进行阳性克隆的筛选，送样测序。将所测定的序列在GenBank数据库中进行BLAST分析[24]。

采用最大简约法（MP）分析方法对数据进行分析，运用PAUP 4.0 BETA建立系统进化树[25]。

拮抗细菌分子鉴定方法与冰核细菌鉴定方法相同，加测gyrA基因序列。

2 结果与分析

2.1 冰核细菌的分离

从贵州省贵阳市、六盘水市、黔西南州和铜仁市等4个市、州采集的59种霜冻植物标本上，分离获得7株冰核细菌，编号为B-A、B-B、B-C、B-D、B-E、B-F和B-G。

B-A寄主植物为八角金盘（F. japon-ica），采集地点盘县水塘镇丹霞山；B-B寄主植物为白菜（B. pekinensis），采集地点贵阳市高坡乡；B-C寄主植物为白花苜蓿（T. repens），采集地点贵阳市黔灵公园； B-D寄主植物为茼蒿（C. coronarium），采集地点六盘水市钟山区；B-E寄主植物为柑橘（C. reticulata），采集地点贵阳市小车河公园；B-F的寄主植物为白菜（B. pekinensis），采集地点贵阳市高坡乡；B-G寄主植物是矮牵牛（P. hybrida），采集地点贵阳市景云山。

2.2 冰核细菌拮抗细菌的筛选

从贵阳市、六盘水市采集32份土样，分离放线菌和细菌。经初筛与复筛，筛选出3株对冰核细菌有抑制效果的拮抗菌：1株放线菌，编号为F1；2株细菌，编号为XD和XF。F1、XD和XF对冰核细菌B-C都有一定的拮抗作用（图1）。对冰核细菌B-G有拮抗效果的只有XF（图2）。十字交叉法测量抑菌圈，XF对B-C的拮抗效果最好，抑菌圈平均直径达18.35 mm；XD对B-C的拮抗效果次之，抑菌圈平均直径是17.81 mm； F1对B-C的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直径是12.67 mm。XF对B-G抑菌圈平均直径是13.65 mm。

2.3 冰核细菌鉴定

2.3.1 冰核细菌的形态与特征生理生化反应 对7株冰核细菌进行形态特征观察和生理生化反应试验，结果见表4。从表4可以看出，B-D和B-E的需氧性反应为兼性厌氧，与其他5株细菌不同，G-。

2.3.2 16S rDNA序列分析 对7株冰核细菌的16S rDNA片段进行测序，在NCBI上用BLAST 程序与登录的序列进行比对。7株冰核细菌中，2株为泛菌属（Pantoea），5株为假单胞属（Pseudomonas）。

图3为假单胞属（Pseudomonas）5个菌株的系统发育树，图4为泛菌属（Pantoea）2个菌株的系统发育树。

由图3可知，B-B與荧光假单胞（P. fluorescens）在一个类群；B-C、B-F与丁香假单胞（P. syringae）在一个类群；B-A、B-G与绿黄假单胞菌（P. virid-iflava）在一个类群。

结合形态特征与生理生化反应结果，可确定菌株B-B为荧光假单胞（P. fluorescens），菌株B-C和B-F为丁香假单胞（P. syringae），菌株B-A和B-G是绿黄假单胞菌（P. viridiflava）。

由图4可知，B-E与成团泛菌（P. agglomerans）在一个类群； B-D与菠萝泛菌（P. ananatis）在一个类群。结合形态特征与生理生化反应结果，可确定菌株B-E为成团泛菌（P. agglomerans）， 菌株B-D为菠萝泛菌（P. ananatis）。

2.4 冰核细菌拮抗菌的鉴定

2.4.1 放线菌形态特征 形态特征：放线菌 F1在高氏合成1号培养基上，气生菌丝灰白色，基内菌丝褐色，可溶性色素暗褐色。显微镜下观察，孢子链直或柔曲，孢子卵圆形，表面光滑。

放线菌F1在6种培养基上的培养性状、菌落颜色和色素颜色等特征见表5和图5。

2.4.2 放线菌分子鉴定 基于16S rDNA序列构建的系统发育树见图6。从系统发育树中可知，F1与暗产色链霉菌（S. phaeochromogenes）在一个类群。

结合16S rDNA序列分析与菌落形态、培养特征、气生菌丝和基内菌丝的颜色、可溶性色素的有无及颜色、并采用插片法观察孢子链及其孢子的形状，放线菌F1鉴定为暗产色链霉菌（S. phaeochromogenes）。

2.4.3 拮抗细菌的鉴定

2.4.3.1 拮抗细菌形态特征和生理生化测试。油镜下观察2株拮抗细菌，菌体均呈直杆状，G+，都能产芽孢，芽孢为蓝绿色，呈卵圆形或椭圆形。

由菌株XD、XF的生理生化反应结果（表6）可以看出，菌株XD与XF的M.R试验结果不同，其余反应均一致。

2.4.3.2 拮抗細菌分子鉴定。将2株拮抗细菌gyrA基因序列与16s rDNA序列调整后拼接在一起，形成2条多基因序列，将这2条多基因序列与其他菌株序列一起用PAUP4.0建立系统发育树（图7），进行多基因分析。

由图7可知，XF、XD与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）在一个类群。

结合2株芽孢杆菌形态特征、生理生化反应以及16S rDNA和gyrA多基因分析，菌株XF和XD为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）。

3 讨论

从6种霜冻植物上分离到7株冰核细菌，贵阳市高坡乡白菜上分离到2株；7 株冰核细菌中，2株为泛菌属（Pan-toea），5株为假单胞属（Pseudomonas）；从分离冰核细菌的地点看，贵阳市分离到5株，水城市分离到2株，铜仁市和兴义市未分离到。

韦建福等在1992—1994年，采集27种植物分离到欧文氏菌属（Erwinia）、黄单胞菌属（Xanthomonas）和假单胞菌属（Pseudomonas）3个属的冰核细菌[28]；黄晓琴等从茶树上分离到菠萝泛菌（P. ananatis）和成团泛菌（P. agglom-erans）2种冰核细菌[29]。该试验未分离到欧文氏菌属（Erwinia）和黄单胞菌属（Xanthomonas）的冰核细菌。

从土壤中分离到3株拮抗菌，2株为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefa-ciens），1株为暗产色链霉菌（S. phaeo-chromogenes）。

解淀粉芽孢杆菌在其生长过程中产生一系列脂肽类物质、聚酮类物质还有具有蛋白活性的抑菌物质，包括表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和芬荠素（fengycin）等几大类物质，这些物质对细菌、真菌、病毒和支原体有良好的抑制作用[30-31]。该试验从土壤中分离的2株解淀粉芽孢杆菌对冰核细菌有很好的抑制作用，可能是解淀粉芽孢杆菌产生的一系列抑菌物质对冰核细菌产生了抑制作用。

放线菌是土壤里的优势菌种，并且种类繁多，能产生大量的酶、抗生素和酶抑制剂等生物活性物质，由于放线菌这些特性，在植物病害的生物防治方面有着广泛的应用[32]。而放线菌目（Actinomycetes）中最大的一个属是链霉菌属（Streptomycetes）。链霉菌的生防作用主要靠其产生的抗生素实现，此外，还可产生代谢产物，包括蛋白酶、几丁质酶和果胶酶等多种胞外水解酶[33]。

参考文献

[1] 孙福在. 我国生物冰核研究进展[J]. 中国农业科学， 1996，29（5）：62-68.

[2] MAKI L R， GALYAN E L， CHANG-CHIEN M M， et al. Ice nucleating induced by Pseudomonas syringae[J]. Applied Micro-biology， 1974，28：456-460.

[3] 姜莉， 缪卫国， 努尔孜亚， 等. 冰核细菌的研究、应用现状和前景[J]. 新疆农业科学， 2002，39（5）：271-274.

[4] SCHNELL R C， VALI G. World-wide source of leaf-derfreezing nuclei[J]. Nature， 1973， 246：212-213.

[5] FENG Y X. Studies on relationship between frost injury to cucumber plants and ice nucleation-active bacteria[J]. Hoticulturae Sinica， 1990， 17（3）：211-216.

[6] LIU J H，TAO Y F， HE W X， et al. Studies on the role of ice nucleation active bacteria in frost injury to maize and soybean[J]. The Chinese Journal of Agricultural Meteorology， 1990， 11（1）：1-6.

[7] SUN F Z， ZHAO T C， YANG J M， et al. Species of ice nucleation active bacteria on the apricot and the relationship between their activity and flower frost[J]. Scientia Agrricultura Sinica， 2000， 33（6）：50-58.

[8] LINDOW S E. Exwinia herbicola：a bac-teria ice nucleus active in increasing frost injury to corn[J]. Phytopathology， 1978， 68：523-527.

[9] LINDOW S E， HIRANO S S， BARCHET W R， et al. Relationship between ice nucleation frequency of bacteria and frost injury[J]. Plant Physiology，1982， 70：1090-1093.

[10] LINDOW S E， ARNY D C， UPPER C D. Bacterial ice nucleation：A factor in frost injury to plants[J]. Plant Physiology， 1982， 70：1084-1089.

[11] LINDOW S E. Methods of preventing frost injury through control of epiphytic ice nucleation active bacteria[J]. Plant Disease， 1983，67：327-333.

[12] LINDOW S E， ARNY D C， UPPER C D， et al. The role of bacterial ice nucleation in frost injury to plant[M]. Salt Lake City：Academic Press， 1978：249-263.

[13] 鲍文. 贵州农业气象灾害及其防灾减灾能力建设[J]. 湖北农业科学， 2013， 52（3）：533-537.

[14] 中国气象局. 气象灾害年鉴（2006）[ M]. 北京：气象出版社， 2006：184-189.

[15] GOTO M， GOTO T， INABA T. Identi-fication of ice nucleation-active bacteria isolated from frost-damaged vegetable leaves[J]. Japanese Journal of Phytopath-ology， 1989， 55：330-335.

[16] 崔汝强， 姬广海， 张世珖. 冰核活性细菌拮抗菌株的筛选[J]. 云南农业大学学报， 2004， 19（5）：528-531.

[17] 程丽娟， 薛泉宏， 来航线， 等.微生物学实验技术[M].西安：世界图书出版社， 2000：383-384.

[18] VALI G. Quantitative evaluation of exper-imental results on the heterogeneous freezing nucleation of supercooled liquids[J]. Journal of Atmospheric Sciences， 1971， 28：402-409.

[19] 李小俊， 成丽霞， 吴彦彬， 等.拮抗菌抗菌谱及发酵液拮抗能力测定的新方法[J]. 生物技术， 2007， 17（1） ：55-58.

[20] 东秀珠， 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社， 2001， 1-419.

[21] R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册（第八版）[M]. 中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组译.北京：科学出版社出版年，1984.

[22] 闫逊初. 放线菌的分类和鉴定[M]. 北京：科学出版社，1992.

[23] 张圆圆.防治苹果轮纹病芽孢杆菌的筛选及作用机制初探[D].北京：中国农业大学， 2011：22.

[24] 张飞官，高雅慧，任慧爽， 等. 桑疫病病原拮抗菌的分离、鉴定及发酵条件优化[J]. 微生物学报， 2013， 53（12）：1285-1294.

[25] SWOFFORD D L. PAUP：Phylogenetic analysis using parsimony（*and other methods），Version 4.0 b10[M]. Sunderland MA：Sinauer Associates， 2003.

[26] 徐爱玲， 吴等等， 宋志文， 等. 引物选择对污泥微生物多样性分析的影响[J]. 环境科学， 2013， 34（9）：3620-3625.

[27] CHUN J， BAE K. Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences[J]. Antonie van Leeuwenhoek， 2000， 78：123-127.

[28] 韦建福， 孙福在， 张世光， 等. 云南植物上冰核活性细菌鉴定[J]. 微生物学通报， 1996， 23（2）：74-77.

[29] 黄晓琴， 束怀瑞， 张丽霞， 等. 冰核细菌在山东茶树上的分布规律及消长动态研究[J]. 茶叶科学，2009， 29（4）：289-294.

[30] 孫力军， 王超男， 孙德坤， 等. 植物内生菌Bacillus amyloliquefaciens ES-2菌株对苹果青霉病的抑制效果[J]. 安徽科技学院学报， 2008， 22（1）：16-20.

[31] 陈哲，黄静，赵佳，等.解淀粉芽孢杆菌抑菌机制的研究进展[J]. 生物技术通报，2015， 31（6）：37-41.

[32] 莫婕， 王圣航， 罗锟，等. 玉米灰斑病拮抗链霉菌S3-5的筛选及鉴定[J]. 四川大学学报（自然科学版）， 2016， 53（1）：175-180.

[33] 何其瑞. 淡紫灰链霉菌Xjy发酵过程的优化及对大棚番茄叶霉病的防治[D]. 陕西：西北农林科技大学， 2010：1.

责任编辑：郑丹丹