温肾健脾方对重症肌无力患者免疫功能的影响

张丽香 郭全 郭远瑾 韦俊杰 李吕力 钟维章 蔺心敬 李燕华 李晓峰

〔摘要〕 目的 观察温肾健脾方对重症肌无力（MG）脾肾阳虚型患者外周血B淋巴细胞亚群、白细胞介素-6（IL-6）、B淋巴细胞活化因子（BAFF）表达的影响。方法 入选脾肾阳虚型MG患者18例为观察组，同期健康体检者20例为正常对照组，采用ELISA法检测治疗前、治疗后IL-6、BAFF的水平，采用流式细胞术检测治疗前、后外周血B淋巴细胞亚群比率。结果 MG患者IL-6、BAFF表达明显高于正常对照组（P<0.01），温肾健脾方治疗1月后，MG患者IL-6、BAFF水平明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）；MG患者治疗前、后CD19+CD27+细胞百分比分别为（1.04±0.24）%、（0.96±0.28）%，差异无统计学意义（P>0.05），CD19+CD27-细胞百分比分别为（3.02±1.12）%、（2.12±0.42）%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 温肾健脾方对MG患者有一定的免疫调节作用，其机制可能与降低外周血中未分化B淋巴细胞数量及BAFF、IL-6水平有关。

〔关键词〕 重症肌无力；温肾健脾方；B淋巴细胞亚群；IL-6；BAFF

〔中图分类号〕R256.3；R746.1 〔文献标志码〕B 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.024

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Wenshen Jianpi decoction on the immunologic function in spleen-kidney yang deficiency patients with myasthenia gravis. Methods 18 MG patients with spleen-kidney yang deficiency were selected as observation group and 20 healthy subjects were selected as normal control group in the same period. The levels of BAFF and IL-6 were measured by ELISA and the percentage of B lymphocyte subsets in peripheral blood was detected by flow cytometry before and after treatment. Results The expression of IL-6，BAFF in MG patients were significantly higher than the normal control group （P<0.01）. After Wenshen Jianpi decoction treatment for 1 month， the levels of IL-6 and BAFF in MG patients decreased significantly （P<0.01）. The percentage of CD19+CD27+ cells before and after treatment were （1.04±0.24）%， 0.96±0.28）%， the percentage of CD19+CD27- cells before and after treatment were （3.02±1.12）%，（2.12±0.42）%， the differences were ststistically significant（P<0.05）. Conclusion Wenshen Jianpi decoction has exact effects on immune regulation in patients with myasthenia gravis， and the mechanism may be related to reducing the number of undifferentiated B lymphocytes and the levels of BAFF and IL-6 in peripheral blood.

〔Keywords〕 myasthenia gravis； Wenshen Jianpi decoction； B lymphocyte subsets； IL-6； BAFF

重癥肌无力（myasthenia gravis， MG）是一种乙酰胆碱受体抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与、以神经-肌肉接头传递功能障碍为特征的获得性自身免疫性疾病。目前西医多采用胆碱酯酶抑制剂、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂、静脉注射免疫球蛋白、免疫吸附、血浆置换等治疗，外科多采用胸腺切除法以及造血干细胞移植疗法，治疗方法虽多，但是副作用较大。既往的临床观察发现全身型MG患者多具有脾肾阳虚症状为主的中医症候特点[1-2]，在此基础上，本研究应用ELISA法检测脾肾阳虚型MG患者外周血白细胞介素-6（lnterleukin 6，IL-6）、B淋巴细胞活化因子（b-cell activating factor，BAFF）水平，流式细胞术检测B淋巴细胞亚群分布变化，探讨温肾健脾方对MG患者的免疫调节作用机制。

1 资料与方法

1.1 观察对象

MG病例来源系广西壮族自治区人民医院2010年10月至2013年10月期间神经内科门诊及住院患者，根据中国神经免疫学会诊断标准[3]确诊MG；按照中医脾肾阳虚症候：眼睑下垂，复视，咀嚼、抬颈无力，四肢倦怠无力，畏寒肢冷，吞咽困难，面色白，腹部冷痛，久泄久痢或便溏、完谷不化，小便清长，或浮肿少尿，舌淡胖，苔薄白或白滑，脉沉迟无力或脉沉细，入选脾肾阳虚型新发病MG患者18例，按照改良Osserman临床分型[4]，Ⅱa型5例、Ⅱb型13例；排除激素、免疫抑制剂治疗史以及其他自身免疫性疾病，其中男6例，女12例，年龄（35.6±8.4）岁。对照组为同期健康体检者20例，其中男8例，女12例，年龄（34.2±9.4）岁，无自身免疫性疾病，近期内未服用影响免疫功能药物。两组性别、年龄、民族差异无统计学意义（P>0.05），所有受检者均知情同意研究内容后纳入。

1.2 治疗方法

（1）溴吡啶斯的明：根据患者病情严重程度，分别从60 mg每日3次至120 mg每日4次，长期规律口服；（2）中药治疗： 患者经中医辨证诊断后口服温肾健脾方（补中益气汤、金匮肾气汤加减）：黄芪60 g，党参30 g，白术15 g，当归15 g，陈皮15 g，柴胡15 g，升麻15 g，熟地黄15 g，山萸肉25 g，菟丝子25 g，山药15 g，牛膝10 g，制附子3 g，丹皮6 g，泽泻6 g，鹿角12 g，巴戟25 g，甘草6 g。每日1剂，疗程1个月。

1.3 观察指标及方法

治疗前、治疗1月后分别检测患者外周血IL-6、BAFF水平及B淋巴细胞亚群比率。

1.3.1 IL-6、BAFF水平测定 所有受试者均于清晨空腹采血6 mL，其中1 mL离心取上清，置于EP管内-80 ℃保存，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）对所有标本一次性进行测定，所有试剂盒均由Rapidbio Lab提供，严格按照试剂盒说明书要求程序进行操作。酶标仪（GF-M3000型酶标仪）450 nm 处测A值，绘制标准曲线，计算BAFF和IL-6浓度值。

1.3.2 B淋巴细胞亚群比率测定 受试者静脉血5 mL，置于肝素钠抗凝管，加入等倍磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，缓慢加于人淋巴细胞分离液之液面上，以3 000 r/min离心15 min，收集第二层细胞（淋巴细胞），1% PBS反复洗涤2次，计数后取100 μL细胞悬液加入相关表面抗体及同型对照抗体5 μL，4 ℃避光孵育30 min，常温下用2 mL 1%PBS洗2次，加入300 μL 1%多聚甲醛固定，4 h内行流式细胞仪检测。上机收集1×104个细胞，使用Cell Quest软件分析阳性细胞百分率。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以“x±s”表示，治疗前后进行配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组MG患者外周血IL-6和BAFF水平

治疗前脾肾阳虚型MG患者外周血中IL-6、BAFF的水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），温肾健脾方治疗1月后，MG患者IL-6、BAFF水平均明显下降（P<0.01），见表1。

2.2 两组MG患者温肾健脾方治疗前后B淋巴细胞亚群的表达

治疗前脾肾阳虚型MG患者外周血CD19+CD27+细胞表达及CD19+CD27-细胞表达明显高于对照组（P<0.01），温肾健脾方治疗后CD19+CD27+细胞表达较治疗前略下降，但差异无统计学意义（P>0.05）；CD19+CD27-细胞表达较治疗前明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

MG主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳、晨轻暮重，活动后加重，休息后或服用胆碱酯酶抑制剂后减轻等特点。中医学并无重症肌无力病名诊断，根据该病临床表现归属中医“萎证”范畴。病位在脾肾肝，以虚多见。脾主运化，主肌肉，脾虚则运化和散精功能失常，水谷精微内不能供养五脏六腑，外不能濡养肌肉关节；肾主藏精，主生长发育，肾虚则脏腑功能减退，筋骨痿软乏力。根据国内文献报道[5]，应用补中益气汤治疗MG取得较好的临床疗效，但具体机制尚不清楚。

脾肾阳虚证型是临床全身型MG最常见病证类型，常發生于MG发病进程中。根据脾肾阳虚的病机特点，当循“虚者补之”“损者益之”，治法以健脾益肾为主，在补益脾胃药中加温补肾阳之品。《黄帝内经》提出“治痿独取阳明”，在此基础上后世医家对痿证的病因、病机研究更加深入，北宋时期的窦材将痿证的发病归之于肾，提出温补肾阳、壮火起痿等治法，明代《普济方》记载了金刚丸、牛膝丸等治疗“肝肾不足”之痿证。温肾健脾方源自补中益气汤、金匮肾气汤加减而成，方中黄芪、党参、茯苓、甘草、白术、山药、陈皮健脾益气，柴胡、升麻升阳举陷，鹿角、巴戟天、制附子、菟丝子、牛膝、山萸肉温补肾阳，熟地黄、丹皮、泽泻滋补肝肾阴虚。纵观全方，共奏健脾益气、温补肾虚之效。

人体外周血中B细胞亚群主要为未活化的未成熟B细胞、初始B细胞以及活化的记忆性B细胞、浆母细胞[6]。CD19+CD27-细胞标记了未活化的未成熟B细胞及初始B细胞，而CD19+CD27+细胞标记了活化的记忆性B细胞及浆母细胞。既往研究发现[7-8]，BAFF主要表达在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、生长因子刺激的中性粒细胞和活化的T细胞表面，BAFF信号对T淋巴细胞的活化发挥着共刺激作用。BAFF过度表达可以导致B细胞严重增生、降低B细胞的耐受性，促进体内自身抗体产生，产生自身免疫反应[9]。II-6可促进B细胞增殖、分化和分泌抗体，在活化、增殖的B细胞分化为浆细胞的过程中起关键作用。既往的研究中发现，新发病MG患者，尤其是Ⅱb型和Ⅲ型患者中，IL-6、BAFF表达一致性增高[10]。Dalakas等[11-12]研究也证实，MG患者BAFF表达明显增高，T、B淋巴细胞在MG发病中具有协同作用， 控制B淋巴细胞的功能异常是治疗MG的关键。国内研究表明[13]，以黄芪、党参、茯苓、甘草、白术为主的健脾益气为主的中药，有助于抑制B淋巴细胞代谢和增殖，具有调节体液免疫功能。本研究发现，脾肾阳虚型MG患者外周血CD19+CD27-细胞及BAFF表达明显增高，提示MG患者体内存在B细胞亚群功能紊乱，由于CD19+CD27-细胞代表未活化B细胞，BAFF能促进B细胞活化增殖，并延缓其凋亡，MG患者体内未活化B细胞增高可能是由于BAFF表达增加所致，这些增多的未活化B细胞会进一步被激活为活化B细胞，参与MG的发病；以补中益气汤为基础的温肾健脾方能够降低MG患者CD19+CD27-细胞及BAFF、IL-6表达水平，但CD19+CD27+细胞的表达在治疗前后无明显变化，由于MG患者免疫功能障碍机制复杂，抑制未活化B细胞表达并不能完全纠正患者体内的免疫功能紊乱。Lebrun等[14]研究发现，利妥昔单抗能有效抑制MG的复发，通过监测重新出现的CD27+记忆B细胞，可安全降低利妥昔单抗给药频率。提示MG患者外周血CD27+细胞亚群的作用仍需进一步探讨。

綜上所述，脾肾阳虚型MG患者存在以CD19+CD27-细胞及BAFF表达增高为特征的免疫功能紊乱，温肾健脾方可能通过抑制BAFF、IL-6的表达，降低未活化B细胞的比率，从而发挥对MG的免疫调节作用。

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