万古霉素发酵工艺研究进展

张菊芳

摘 要：万古霉素是一种糖肽类抗生素，对革兰氏阳性菌有一定的抑制作用。其发酵工艺比较特殊，影响万古霉素发酵的因素很多，主要包括发酵培养基和发酵培养条件，以及菌种本身的影响。本次研究结合实际发酵情况对各种影响因素进行分析，致力于探究万古霉素的工艺应用要求。

关键词：万古霉素；发酵工艺；碳（C）源；溶解氧

中图分类号：TQ927 文献标识码：A 文章编号：1003-5168（2018）07-0146-02

Progress in the study of vancomycin fermentation process

ZHANG Jufang

（Hangzhou Sino-US Huadong Pharmaceutical Co.， Ltd.，Hangzhou Zhejiang 310000）

Abstract： Vancomycin is a glycopeptide antibiotic， which has a certain inhibitory effect on Gram-positive bacteria. The fermentation technology is very special， which has many influence factors on vancomycin fermentation， mainly including fermentation medium and fermentation conditions， as well as the influence of strain itself. This study combined with the actual conditions of fermentation to analyze the various influencing factors and to explore the application requirements of vancomycin.

Keywords： vancomycin；fermentation process；carbon （C） source；dissolved oxygen

萬古霉素的抗生素属于一种糖肽类抗生素，根据实际应用情况可知，该药物是当期临床研究中治疗感染疾病的首选药物。根据实际治疗要求可知，药物本身是抵抗耐药细菌的最后一道防线，本身有一定的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，受到广泛的关注和重视。

1 影响万古霉素发酵的因素及实际生产应用

万古霉素是由McCormick等于1956年从印度尼西亚土壤中筛选到的一株被称为东方拟无枝酸菌的发酵液中分离得到的具有抗革兰氏阳性菌的一种糖肽类抗生素[1]，同期由美国礼莱公司开发成产品，并于1958年获FDA批准上市。万古霉素发酵过程受到多种因素的影响，包括碳（C）源、氮（N）源、温度、pH和溶解氧等，具体影响如下。

1.1 碳（C）源

碳（C）源在细胞供给及其他方面具有关键性作用。碳（C）源是既是一种碳素来源又能为生长代谢提供能量。考虑到生产实际应用情况，为提高发酵单位产量，对碳（C）源种类的优化筛选就变得尤为重要。在进行碳（C）源优化过程中，要了解配方中碳（C）源的组成部分，分析不同碳（C）源起到的作用是否相同。通过唯一碳（C）源实验，对多种碳（C）源进行单一考察，筛选出对菌体生长和产抗有促进作用的碳（C）源，如淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、豆油和甘油等。当筛选出对生长和代谢有促进作用的碳（C）源后，可进行多种碳（C）源的组合考察以获得发酵最高产量。在发酵过程中，要考虑到菌体生长和代谢产物两方面的要求。为促进早期菌体生长，可选用像葡萄糖、蔗糖等快速利用的碳（C）源；而为了产抗和维持菌体后期的营养，可采用糊精、淀粉类等缓释碳（C）源，最终实现快速而稳定发酵，使产量达到最高。而甘油则作为产物合成的特殊因子，在发酵过程中发挥着关键作用。

1.2 氮（N）源

氮（N）源属于微生物菌体细胞物质，促进菌体生长。氮素来源有很多，可分为有机氮（N）源和无机氮（N）源。有机氮（N）源又包括两种：速效氮（N）源，如蛋白胨、酵母浸出粉等；缓释氮（N）源，如黄豆粉、蛋白粉、酵母粉等。复合有机氮（N）源往往是一些缓释氮（N）源，其含有的成分较复杂，有些氮（N）源还含有特殊的生长因子或维生素等物质，对代谢产物产量的提高起着关键性作用。而无机氮（N）源则主要有硝酸盐、氨水等。无机氮（N）源通常被当作一种辅助氮源，但其作用也较为关键。如氨水在发酵过程中除了提供N素来源，还起到维持pH的作用。

在生物合成抗生素的整个过程中，如何合理有效利用氮（N）源，实现合理化和有序化应用是关键。万古霉素发酵培养基的氮源分有机和无机两种，有机氮源的整体化作用较为突出，具体考察的氮（N）源有：大豆蛋白胨、酵母蛋白胨、大豆蛋白粉、黄豆粉、酵母粉、麸质粉和棉籽饼粉等。经实验发现，酵母粉、麸质粉不能被菌体利用，而棉籽饼粉和大豆蛋白粉能使菌体生长速度加快，发酵周期变短，抗生素的合成周期也缩短，提升发酵优势。而蛋白胨类在发酵前期能促进菌体快速生长，但后期菌体活力不够。因此，培养基的选择可将速效氮（N）源蛋白胨和缓释氮（N）源棉籽粉进行混搭培养，最终使效价得到提高。

1.3 温度和pH值

菌体生长繁殖及产物合成等都是以酶的催化作用为基础，而酶的催化与温度和pH相关，以动力学因素为前提，如何进行有序化控制成为研究的关键。在一定范围内，温度值不断提升，酶的活性也随之提升，当超过其最高值后就会对酶本身产生破坏作用，因此要做好酶的反应速率评估工作。在发酵过程中，菌体生长和产物代谢其最适合的温度很可能是不一致的，因此，在速率分析过程中，为了避免活性因素受到影响，整个发酵过程要维持合适的菌体生长环境，以最佳温度为基础，提前确定应用条件。

1.4 溶解氧

抗生素产生菌多以异养好氧型微生物为主。根据生长繁殖及抗生素的实际应用情况可知，要确定菌体对溶氧的需求量。随着发酵的进行，菌量上升，菌体对氧的需求量也逐渐提升。从王会会、栗婷婷和赵建辉[2]《万古霉素发酵工艺研究进展》可知，以菌种本身作为基础，高产菌株和发酵条件是不断变化的，抗生素发酵单位容易受到影响。经实验发现，在万古霉素发酵过程中，菌体在不同培养基中其菌丝状态、发酵液粘稠度等都不一样，引起的氧传递不一样，最终影响菌体生长和代谢。因此，以设备供氧和通气量为前提，根據菌体的特征可以选用合适的培养基来改善发酵液的氧传递。

溶氧浓度是发酵过程中的一个综合性参数，以现有监控机制和管理形式作为基础，需要对整个发酵过程的溶氧含量进行监测，溶氧过高或者过低都会产生不良影响。Clark等通过研究溶氧对万古霉素发酵单位的影响，指出只有在溶解氧充足的情况下万古霉素才能正常合成；当溶氧不足时，氧的同化作用不足以满足万古霉素生物合成所需的能量，限制了产物的生成，降低了万古霉素发酵单位；发酵过程中溶氧过低，菌体生长代谢受到抑制，最终影响发酵产物的产量。而溶氧偏高则又说明发酵存在多种问题：第一，营养物质缺乏导致耗氧量降低，溶氧回升，这时需要补充营养物质；第二，菌体本身活力不够，菌体老化自溶导致物质释放，需氧量降低导致溶氧回升。因此，控制合适的溶氧是非常必要的。

2 万古霉素抗性菌株的选择

耐万古霉素突变菌株的选育是获得高产菌株的一种有效途径。紫外诱变是菌种选育的常用方法，而为了解除万古霉素发酵过程中产物的反馈抑制，可将诱变后的菌落涂布于不同万古霉素浓度梯度平板上筛选其抗性菌株。具体考察方法和结果见表1。

诱变后不同菌株对万古霉素的抗性如表2所示。

由此可证明，紫外诱变加上万古霉素抗性筛选是获得高产菌株的最佳方法。同时，不同的菌株其耐万古霉素的能力是不一样的。

3 结语

国内外科研工作者对万古霉素高产菌株的选育非常重视，除了菌种选育外，还致力于提升抗生素发酵产量及质量的提升。对于发酵工艺可进行多方面的化，结合目前不同的培养基原料，筛选合适的培养基原料，同时对发酵的培养条件进行优化，最终得到高产量的万古霉素。

参考文献：

[1]Ramakrishnan Nagarajan. Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and related glycopeptides [J].Antimicrobial agents and chemotherapy，1991（4）：605-609.

[2]王会会，栗婷婷，赵建辉.万古霉素发酵工艺研究进展[J].煤炭与化工，2013（5）：56-58.