转SoSUT5基因甘蔗的生长特性

王露蓉 黄婵 顾彩彩 宋奇琦 杨丽涛 邢永秀 农友业 李杨瑞

摘要：【目的】研究甘蔗蔗糖轉运蛋白SoSUT5基因对甘蔗主要农艺性状和相关生理生化特性的影响，为评价转基因甘蔗的生长情况及验证SoSUT5基因的功能提供参考。【方法】通过PCR扩增和测序验证6个转SoSUT5基因甘蔗品系（T1、T2、T3、T6、T9和T11），以野生型甘蔗B8植株为对照，在苗期、分蘖期、伸长期和成熟期分别测定甘蔗的株高、茎径、叶绿素相对含量和+1叶叶面积，成熟期时测定蔗茎的可溶性糖含量。【结果】通过PCR扩增测序获得6个转SoSUT5基因甘蔗品系的目的基因序列，表明导入的SoSUT5基因已整合到甘蔗基因组DNA中。除T6外，其他5个转基因甘蔗品系的株高、茎径和+1叶叶面积均高于对照，其中成熟期时5个转基因甘蔗品系的茎径和+1叶叶面积均显著高于对照（P<0.05，下同），T1、T2和T9的株高及T1、T2和T11的叶绿素相对含量显著高于对照。成熟期时6个转SoSUT5基因甘蔗品系的可溶性总糖含量均高于对照，其中T2、T9和T11的可溶性总糖含量极显著高于对照（P<0.01），分别比对照高40.3%、40.3%和33.4%。【结论】SoSUT5基因在甘蔗中过表达可促进甘蔗生长，并可提高蔗茎的可溶性总糖含量。由此推测，该基因可能与甘蔗节间糖分积累有关，且对甘蔗生长起促进作用。

关键词： 甘蔗；SoSUT5基因；农艺性状；可溶性总糖含量

中图分类号： S566.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）05-0857-06

Growth characteristics of SoSUT5 transgenic sugarcane

Abstract：【Objective】The present study was carried out to investigate the influence of sucrose transporter SoSUT5 gene on main agronomic traits and related physiological and biochemical characteristics of sugarcane， and provide refe-rences for evalua-ting growth of the transgenic sugarcane and verifying the function of six SoSUT5 genes. 【Method】The SoSUT5 transgenic sugarcane lines（T1， T2， T3， T6， T9 and T11） were verified by PCR amplification and sequencing. Taking wild sugarcane B8 plant as control， agronomic characters such as plant height，stem diameter， relative chlorophyll content and +1 leaf area were measured at seedling stage，tillering stage，elongation stage and mature stage respectively，and soluble sugar content in stem were determined at mature stage. 【Result】Six target gene sequence of SoSUT5 transge-nic sugarcane lines were obtained by PCR amplification and sequencing，indicating that the introduced SoSUT5 gene has been integrated into sugarcane genomic DNA. Except for line T6，the plant height，stem diameter and +1 leaf area in the other five lines were higher than those of control. Among them， the stem diameter and +1 leaf area of five transgenic su-garcane lines were significantly higher than those of control at mature stage（P<0.05， the same below）， the plant height of T1， T2 and T9 and the relative chlorophyll content of T1， T2 and T11 were significantly higher than those of control. The soluble sugar content in the six transgenic lines were higher than the control at mature stage，among which， those of T2， T9 and T11 were extremely higher than that of control（P<0.01）， and were 40.3%， 40.3% and 33.4% higher than that of control respectively. 【Conclusion】Overexpression of SoSUT5 gene in sugarcane can promote sugarcane growth and increase soluble sugar content. Therefore， it is inferred that this gene is related to sugar accumulation in the sugarcane internodes and may promote the growth of sugarcane.

Key words： sugarcane； SoSUT5 gene； agronomic trait； total soluble sugar content

0 引言

【研究意义】甘蔗是重要的糖料作物之一，在世界食糖总产量中，蔗糖约占75%，在我国则占90%以上（李杨瑞和杨丽涛，2009）。随着分子生物技术的发展，转基因技术将促进甘蔗的改良和进化（杨翠凤等，2014）。有研究表明，位于细胞质膜上的蔗糖转运蛋白（Sucorose transporter，SUT）在介导蔗糖向韧皮部装载的过程中起重要作用（Eom et al.，2011；Payyavula et al.，2011）。SoSUT5基因编码蛋白具有蔗糖转运活性，与蔗糖的积累密切相关（牛俊奇等，2017）。因此，研究转SoSUT5基因甘蔗的生长特性，选育出性状优良的转基因甘蔗，可为甘蔗高糖育种提供参考依据。【前人研究进展】植物SUT蛋白结构较保守，属于12次跨膜的膜蛋白基因家族，前人对已完成基因组测序的8个单子叶和10个双子叶植物的SUT基因进行聚类分析，结果表明，该基因家族可分为SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5共5个亚族，其中SUT2和SUT4为单、双子叶所共有的基因，SUT1为双子叶特异基因，而SUT3和SUT5为单子叶特异基因（张清等，2016）。Riesmeier等（1992）将菠菜的cDNA导入不具转运蔗糖及转化酶活性的酵母突变株，以蔗糖作为单一碳源培养基进行培养，发现该突变株可生长，首次证实植物体内有SUT蛋白存在。随后，又在诸多植物体内发现SUT基因，如马铃薯（Riesmeier et al.， 1993）、拟南芥（Sauer and Stolz， 1994）、水稻（Hirose et al.，1997）、胡萝卜（Shakya and Sturm， 1998）和芹菜（Noiraud et al.， 2000）等。Hirose等（1997）从水稻中克隆出第一个单子叶SUT基因（OsSUT1），其他4个水稻SUT基因（OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4和OsSUT5）被相继推定并得到验证（Aoki et al.，1999）。洪海强（2008）研究表明，OsSUT5在生殖器官等库组织中的表达量相对其他组织器官较高，与作物产量形成有关。Sun等（2011）将OsSUT2和OsSUT5转化至马铃薯后，发现转基因植株的单株产量、块茎数量及单株块茎的糖和淀粉平均含量均高于对照。Ludwig等（2000）认为AtSUC5不仅具有蔗糖转运功能，还可转运维生素H。Milne等（2013）发现高粱的SbSUT5基因在其茎中表达。牛俊奇（2015）从甘蔗中首次克隆获得SoSUT5基因，基因全长序列为1605 bp，编码534个氨基酸，其编码的蛋白分子质量为56.40 kD，理论等电点（pI）为10.68；并初步发现SUT基因参与植物糖分的积累和代谢，进而影响植物的生长发育（牛俊奇等，2017）。赵文慧（2016）通过农杆菌转化法将SoSUT5基因转入甘蔗中，经过PPT抗性筛选和PCR检测，获得了转SoSUT5基因阳性植株。【本研究切入点】本课题组已获得的转SoSUT5基因阳性甘蔗植株有待进一步验证，尤其是所转基因能否正常表达及其对甘蔗生长和糖分积累的影响尚不清楚。【拟解决的关键问题】通过PCR检测和测序验证SoSUT5基因在甘蔗中的表达及其对甘蔗主要农艺性状和相关生理生化特性的影响，为研究转基因甘蔗的生长和验证SoSUT5基因的功能提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为T0代转SoSUT5基因甘蔗，由本课题组经农杆菌转化法将该基因克隆转化到甘蔗品种B8中并经PPT抗性筛选获得。T0代转基因甘蔗共有6个品系（T1、T2、T3、T6、T9和T11），对照为野生型B8植株（WT），经种茎沙培育苗，再移栽至温室大棚。

1. 2 试验方法

于2017年在广西大学甘蔗研究所玻璃温室内进行试验。每个品系和对照各种植10株，同行排列，3次重复。每处理随机选取6株甘蔗，每2株的平均值为1次重复，分别在苗期（6月4日）、分蘖期（7月20日）、伸长期（9月5日）和成熟期（10月23日）测定株高、茎径、+1叶（最高可见肥厚带）的叶绿素相对含量（SPAD值）及叶面积，在成熟期测定蔗茎的可溶性总糖含量。

1. 3 转基因甘蔗鉴定

1. 3. 1 甘蔗基因组DNA提取 甘蔗移栽成活后，采集叶片，按DNA提取试剂盒（NuClean Plant Genomic DNA Kit，北京康为世纪生物科技有限公司）说明提取总DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

1. 3. 2 PCR检测 根据pUBTC载体上的选择标记bar基因设计一对引物，分别为bar F（5'-CGGATGAGCCCAGAACGACGCCC-3'）和bar R（5'-CGG

TCAGATCTCGGTGACGGGCAG-3'），扩增产物长度549 bp。以提取的DNA为模板进行PCR扩增，设pUBTC-SoSUT5为阳性对照，非转基因B8植株DNA为阴性对照，用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用胶回收试剂盒（Biospin Gel Extraction Kit，BioFlux公司）回收PCR产物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1. 4 测定项目及方法

1. 4. 1 农艺性状测定 株高为从地面至蔗株+1叶叶基的距离，用卷尺測量；茎径为蔗茎中部的粗度，用游标卡尺测量；叶片SPAD值使用SPAD-520型叶绿素含量测定仪（柯尼卡美能达公司）测定；叶面积使用CI-203激光叶面积仪（美国CID公司）测定。

1. 4. 2 可溶性总糖含量测定 成熟期取甘蔗成熟茎（蔗茎中部），将甘蔗节间去皮并切成小块，用液氮磨成均匀粉末，参照牛俊奇（2015）的方法提取糖分，采用硫酸蒽酮法测定样品中的可溶性总糖含量（李合生等，2000）。

1. 5 统计分析

试验数据采用SPSS 18.0和 Excel 2013进行统计分析及制图。

2 结果与分析

2. 1 甘蔗总DNA提取结果

琼脂糖凝胶电泳检测结果（图1）显示，6个转基因甘蔗品系及野生型甘蔗的电泳条带清晰，说明提取的DNA无杂带和降解，可用于后续试验。

2. 2 PCR检测结果

由图2可看出，6个转基因甘蔗品系扩增获得的条带均与阳性对照条带一致，而阴性对照的条带呈弥散状，水的条带与阳性对照不一致，可能是引物二聚体。6个转基因甘蔗品系的扩增产物经胶回收纯化后进行测序，并将测序结果在NCBI上进行序列比对分析，结果显示扩增片段的序列与目的基因序列一致，说明6个甘蔗品系均为转SoSUT5基因甘蔗。

2. 3 转基因甘蔗在不同生长期的农艺性状表现

2. 3. 1 转基因甘蔗的株高 由图3可看出，随着甘蔗生长期的推移，转SoSUT5基因甘蔗品系和对照野生型甘蔗的株高均不断增加。苗期时，T9的株高显著高于对照（P<0.05，下同），其余5个转基因甘蔗品系的株高与对照无显著差异（P>0.05，下同）。分蘖期时，T1、T3和T9的株高显著高于对照，T2、T6和T11的株高与对照无显著差异。T1、T2和T9的株高在伸长期和成熟期时分别比对照高27.1%、21.9%、25.8%和43.0%、36.1%、26.7%，差异均达显著水平；其余3个转基因甘蔗品系的株高与对照差异不显著。T6的株高在整个生长发育阶段均低于对照。

2. 3. 2 转基因甘蔗的茎径 由图4可看出，除T6外，其余5个转基因甘蔗品系的茎径在各生长期均高于对照，其中T9与对照间差异达极显著水平（P<0.01，下同）。T1、T2和T3的茎径在分蘖期和伸长期较对照粗，但差异不显著，在成熟期时差异达显著水平，分别比对照高21.62%、17.27%和20.35%；T11的茎径在伸长期和成熟期时分别显著高于对照12.01%和16.06%。

2. 3. 3 转基因甘蔗的SPAD值 由图5可看出，随着甘蔗生长期的推移，T3的SPAD值逐渐降低，其他5个转基因甘蔗品系的SPAD值呈增加—降低—增加的变化趋势。苗期时，T3的SPAD值极显著高于对照；分蘖期时，T1的SPAD值显著高于对照；伸长期时，T2和T6的SPAD值显著低于对照；成熟期时，T1、T2和T11的SPAD值显著高于对照；其他品系与对照差异均不显著。

2. 3. 4 转基因甘蔗的+1叶叶面积 由图6可看出，从苗期到伸长期，转SoSUT5基因甘蔗和对照的+1叶叶面积均不断增大；到成熟期时，T2、T3、T6和对照的+1叶叶面积有所减小，分别较伸长期时减小1.26%、2.62%、2.95%和4.89%，转SoSUT5基因甘蔗的减小程度均低于对照。苗期时，T9的叶面积显著大于对照，其余5个转基因甘蔗品系与对照无显著差异。至伸长期和成熟期时，6个转SoSUT5基因甘蔗品系的叶面积均显著或极显著大于对照，其中以T9的+1叶叶面积最大，T6的最小。

2. 3. 5 成熟期转基因甘蔗的可溶性总糖含量 由图7可看出，转SoSUT5基因甘蔗的可溶性总糖含量均高于野生型对照，其中，T2、T9和T11的蔗茎可溶性总糖含量分别比对照高40.3%、40.3%和33.4%，差异极显著；T1、T3和T6的可溶性总糖含量也略高于对照，但差异不显著。

3 讨论

本研究利用单子叶植物表达载体pUBTC-So-SUT5通过农杆菌转化法导入甘蔗。由于SoSUT5为甘蔗内源基因，pUBTC载体具有选择标记基因bar，因此对标记基因进行PCR扩增并测序，检测目的基因是否已整合到甘蔗基因组DNA中。

SUT基因对植物的生长发育起着重要作用。Kühn等（1996）研究表明，用RNA干扰技术抑制StSUT1基因的表达，可使马铃薯植株生长受限，导致块茎鲜重降低。Shakya和Sturm（1998）研究发现，胡萝卜的DoSUT1基因在叶片中表达，在韧皮部中起装载作用，DoSUT2基因则在库组织的韧皮部中表达。Hackel等（2006）通过反义RNA技术抑制LeSUT1和LeSUT2基因的表达，获得的番茄植株均不结果实，表明SUT基因的沉默严重影响植物的生长。张君武等（2014）研究发现，水稻OsSUT5基因表达受抑制时，愈伤组织诱导再生植株率显著降低，表明在水稻组织培养中OsSUT5基因可影响外植体对蔗糖的吸收和转运。本研究中，过表达SoSUT5基因，除T6外，其余5个转SoSUT5基因甘蔗品系的株高均高于野生型对照，T1、T2和T9在分蘖期和成熟期时显著高于对照；这5个转基因甘蔗品系的茎径也均大于对照，且在成熟期时表现出显著差异。Zhang等（2013）研究发现，在果实膨大期梨的PbSUT1基因表达量最高，且果实的蔗糖含量增加。闫甜甜等（2014）利用基因工程技术将葡萄的VvSUC11和VvSUC12基因导入甜菜块根中，发现转基因甜菜叶面积增大、块茎糖分增加。本研究中，T3在苗期、T1在分蘖期及T1、T2、T9在成熟期时的叶绿素相对含量均显著高于对照，且6个转SoSUT5基因甘蔗品系的+1叶叶面积均高于对照。可见，SoSUT5基因的过量表达可增加甘蔗的株高和茎径，促进甘蔗生长及叶片的叶绿素含量和叶面积增加，有利于光合作用。

可溶性糖不仅为植物的生长发育提供能量，还是调控基因表达和调节植物生长发育的重要信号因子，因此提高可溶性糖含量可促进植物生长（王嘉佳和唐中华，2014）。赵婷婷等（2012）从甘蔗中克隆出ShSUT4、ShSUT3、ShSUT2A和ShSUT2B 4个基因，發现其可促进甘蔗茎秆蔗糖的积累。牛俊奇（2015）首次克隆出SoSUT2、SoSUT3和SoSUT5基因，且发现SoSUT2基因表达量与节间蔗糖含量呈正相关，推测该基因可能参与调控甘蔗节间蔗糖的积累（牛俊奇等，2017）。本研究结果表明，转SoSUT5基因甘蔗品系的可溶性总糖均高于对照，其中T2、T9和T11显著高于对照。可见，SoSUT5基因的过表达可提高甘蔗节间的可溶性糖分，其表达可能直接影响甘蔗糖分运输和积累。

本研究中，不同的转基因甘蔗品系在表现型上有明显差异，可能与SoSUT5基因整合到甘蔗中的拷贝数有关，也可能是因为SoSUT5基因的表达受蔗糖调控（Matsukura et al.，2000；Ransom-Hodgkins et al.，2003）。在今后的研究中，应测定不同转SoSUT5基因甘蔗品系不同部位的SoSUT5基因表达量和糖分含量，进一步确定SoSUT5基因的表达部位与糖分积累的相关性。

4 结论

SoSUT5基因在甘蔗中过表达可促进甘蔗生长，并可提高蔗茎的可溶性总糖含量。由此推测，该基因可能与甘蔗节间糖分积累有关，且对甘蔗的生长起促进作用。

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（責任编辑 王 晖）