混合基质上长枝木霉GF-10固体发酵条件的优化

王成吕 杨鲁栋 王天鹏 杨正军 代园凤 葛永怡

摘 要：长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）GF-10是一株具有较好生防潜力的菌株，为提高其产孢量，本研究通过单因子筛选、正交实验，对该菌在混合基质的产孢条件及培养成分进行了优化。结果表明：当培养基基质净重为8 g，麦麸∶竹炭质量比为16∶1、添加5%葡萄糖、1.5‰ （NH4）2SO4、1.5‰ MgSO4、0.6%KH2PO4和0.5%混合矿质元素，pH=7，接种200 μL （1×107 个/mL）菌悬液，28℃，12 h/d光照，48 h后搅拌，培养7 d时，其最大产孢量为1.25×1010 个/g，比以麸皮为基质的培养条件提高了110.79%。本研究的开展较好的提升了长枝木霉GF-10的产孢量，为该菌的工业生产奠定了基础。

关键词：混合基质;长枝木霉GF-10;固体发酵;正交实验

中图分类号：Q939.96

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）06-0080-07 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.014

木霉菌（Trichoderma spp.）归属于子囊菌门（Ascomycota），粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座菌目（Hypocreales），肉座菌科（Hypocreaceae），是一类广泛存在于土壤中重要的广谱拮抗生物防治菌株[1]，其同植物以及病原菌的三方互作机制[2]使得木霉菌成为一种难得的生防资源，因而被应用于农业病虫害防治、环保等领域。在农业生产中，国际上已有50余种木霉菌生物制剂或菌肥产品获得登记和商业化生产，在农业生产中发挥着重要作用[3]。

木霉菌不仅能够通过竞争[4-5]、重寄生[6-7]、诱导植物抗性物质产生等作用抑制土传病害[8-9]，而且能够有效降解有机磷等农药成分和促进植物生长、增强抗逆性和修复污染环境等功能[1，10-11]。近年来，一些研究发现长枝木霉不仅对核盘菌、细链格孢菌、灰霉病菌等有一定的拮抗作用，并且某些菌株还具有较强的解盐能力[2，12-13]。因此，木霉菌剂的研发对农业生产具有重要意义，而获得优良的木霉菌发酵条件则是木霉菌应用的前提，它是推进木霉菌剂商业化生产的基础。

本研究在前期研究[14]的基础上，拟通过以混合基质为基础培养基，单因子筛选、正交实验对GF-10的发酵条件进行优化，从而进一步提升木霉菌GF-10的产孢能力，为该菌的菌剂生产节约成本。

1 材料與方法

1.1 供试菌株

实验菌株为本实验室分离所得长枝木霉T.longibrachiatum GF-10，现保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉），保藏号：CCTCC M2012383。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL、自然pH值。

麸皮竹炭混合基质培养基：以麸皮为主要成分，向其中加入竹炭作为混合基质培养基，依照试验设计添加碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉），氮源（NaNO3、KNO3、（NH4）2SO4、蛋白胨、豆粉），无机盐（MgSO4、CaCO3、CaSO4、KH2PO4、混合矿质元素）。

1.3 种子液制备

转接4℃环境下保藏的菌种于PDA培养基中活化，28℃恒温光照培养7 d，用含0.5%吐温80的无菌水将孢子洗下，配制成浓度为1.0×107 个/mL的菌悬液，保存于4℃，备用。

1.4 GF-10菌株固态发酵条件优化

1.4.1 不同混合基质比值对GF-10菌株产孢的影响

按照培养基基质净重为8 g的标准，将竹炭研磨成细粉状按比例（麦麸∶竹炭=1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1、32∶1）加入到麦麸中，并设全麦麸培养基为对照组，每组3个重复。121℃灭菌30 min，冷却后接种浓度为1×107 个/mL的GF-10种子液200 μL，于28℃光照培养箱中培养7 d后对各组进行产孢量测定，称取1 g固体混合基质于锥形瓶，加入99 mL蒸馏水与适量玻璃珠，充分震荡摇匀后过滤、稀释、血球计数板计产孢量。以产孢量最优的基质配比配制培养基质进行后续发酵条件的筛选优化。

1.4.2 不同培养周期对GF-10菌株产孢的影响

设置8个实验组，根据1.4.1所得的培养基基质最优比例，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃光照培养箱中培养3、4、5、6、7、8、9、10 d后计数，每组做3次平行实验。

1.4.3 不同接种浓度对GF-10菌株产孢的影响

设置5个实验组，根据1.4.1所得的培养基基质最优比例，高压灭菌锅于121℃灭菌30 min，分别均匀滴加浓度为1×104、1×105、1×106、1×107、1×108 个/mL的GF-10种子液200 μL，每组3个重复，于28℃光照培养箱中培养7 d后计数，每组做3次平行实验。

1.4.4 不同光照条件对GF-10菌株产孢的影响

设置3个实验组，根据1.4.1所得的培养基基质最优比例，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃培养箱分别进行24 h光照培养、12 h光照12 h黑暗交替培养和24 h黑暗培养，7 d后计数，每组做3次平行实验。

1.4.5 不同搅拌条件对GF-10菌株产孢的影响

设置5个实验组，根据1.4.1所得的培养基基质最优比例，分别为对照组不作搅拌处理、灭菌前搅拌均匀、接种后24 h搅拌、接种后48 h搅拌、接种后72 h搅拌、接种后96 h搅拌，7 d后计数，每组做3次平行实验。

1.4.6 不同pH值对GF-10菌株产孢的影响

设置6组实验组，根据1.4.1所得的培养基基质最优比例，用NaOH溶液和稀HCl将水的pH调成4、5、6、7、8、9与基质搅拌均匀，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃光照培养箱进行培养，7 d后计数，做3次平行实验。

1.4.7 不同碳源对GF-10菌株产孢的影响

设置4个实验组与1个空白对照，分别加入基质比重10%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃光照培养箱中培养7 d后计数，做3次平行实验。

初筛得到最佳碳源后，分别加入总重5%、10%、15%、20%的初筛最佳碳源，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃光照培养箱中培养7 d后计数，并设置对照组，做3次平行实验。

1.4.8 不同氮源对GF-10菌株产孢的影响

设5组实验组与1组空白对照组。分别向5组实验组中加入1‰的（NH4）2SO4、1‰的NaNO3、1‰的KNO3、1%的蛋白胨、1%的豆粉，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃光照培养箱中培养7 d后计数，做3次平行实验。

初筛得到最佳氮源后，根据浓度梯度设置实验组，按一定浓度添加氮源后，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃光照培养箱中培养7 d后计数，做3次平行实验。

1.4.9 MgSO4对GF-10菌株产孢的影响

设置4组实验组与1组空白对照。分别向实验组加入0.5‰、1‰、1.5‰、2‰的MgSO4，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃光照培养箱中培养7 d后计数，做3次平行实验。

1.4.10 KH2PO4对GF-10菌株产孢的影响

设置5组实验组与1组空白对照。分别向实验组加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的KH2PO4，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃光照培养箱中培养7 d后计数，做3次平行实验。

1.4.11 混合矿质元素对GF-10菌株产孢的影响

设置6组实验组与1组空白对照。分别向实验组加入1%、2%、3%、4%、5%、6%的混合矿质元素，灭菌接种步骤同1.4.1，于28℃光照培养箱中培养7 d后计数，做3次平行实验。

1.5 正交实验

为进一步获得木霉菌最大产孢量，在单因素条件基础上，以产孢量作为指标，选取光照、搅拌、葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4、混合矿质元素这7个因素设计了3水平的正交实验（表1）。

1.6 统计方法

采用软件SPSS Statistics 22、Microsoft Excel 2003进行数据统计、分析處理。

2 结果与分析

2.1 不同混合基质比值对GF-10菌株产孢的影响

不同麸皮竹炭配比对木霉生长有不同的影响。竹炭的加入有助于发酵，发现麸皮竹炭配比为16∶1时具有较大的绿色产孢面积，产孢量最大，最大产孢量为7.58×109 个/g。当竹炭所占比例继续增加或减少时，产孢量呈下降趋势。竹炭的添加使得培养基的均匀性较好，并且起到吸附营养物质及水分的作用，同时竹炭的多孔结构可以吸附更多的孢子，增大了孢子的收集率，但过多反而会使得培养基致密，抑制发酵。

2.2 不同培养周期对GF-10菌株产孢的影响

培养周期对菌剂的工业化生产效益具有重要影响。通过产孢量计数，小于7 d的培养周期中，产孢量与培养周期呈正相关;大于7 d的培养周期中，产孢量虽有小幅上升但趋于稳定，考虑到工业培养的生产效益比，此处选取培养周期7 d进行后续试验分析。

2.3 不同接种浓度对GF-10菌株产孢的影响

当接种浓度为1×107 个/mL时产孢量达到最大，产孢量为7.81×109个/g。接种浓度低于1×107 个/mL时，绿色产孢面积稀疏，未能充分利用培养空间及营养物质，高于1×107 个/mL时，产孢量呈下降趋势，说明接种浓度过高造成木霉生长空间重叠，从而形成竞争抑制。

2.4 不同光照条件对GF-10菌株产孢的影响

全黑暗的培养条件下，木霉培养基表面遍布白色菌丝，产孢量低;全光照培养条件下，培养表面均呈绿色，产孢量高;光照黑暗交替培养条件下，培养基表面也布满绿色。产孢量进行计数，发现12 h光暗交替培养与全光照培养条件之间产孢量差异显著，全光照培养产孢量最大，其产孢量为5.56×109 个/g。

2.5 不同搅拌条件对GF-10菌株产孢的影响

搅拌能够有效疏松培养基基质以防止凝块，从而加速木霉菌对于水分的汲取与营养物质的吸收，进而提高木霉菌培养的生长速率及产孢效率。通过观察空白对照组木霉菌的长势，发现接种24 h后开始产生白色菌丝体，48 h后菌丝体明显增多。经产孢量计数，接种48 h后搅拌产孢量最高，产孢量为6.12×109 个/g。

2.6 不同pH值对GF-10菌株产孢的影响

通过观察实验组与对照组的菌株长势并进行孢子计数，发现偏酸或偏碱性环境均会影响木霉的生长与产孢，pH值为7时，木霉菌株长势最好，产孢量最大，为9.985×109 个/g。

2.7 不同碳源及添加量对GF-10菌株产孢的影响

本研究通过测试木霉菌对几种碳源的吸收利用效率，发现木霉对葡萄糖的吸收利用效率较高，而淀粉等有机物质甚至还具有抑制作用。因此，本试验设置了葡萄糖浓度梯度，发现葡萄糖添加量为10%时，对于木霉菌发酵的促进效果较为显著，其最大产孢量1.15×1010 个/g。

2.8 不同氮源对GF-10菌株产孢的影响

实验通过测试木霉菌对几种氮源的吸收利用效率，发现木霉对（NH4）2SO4的吸收利用效率较高。因而以硫酸铵为氮源，进一步通过设置（NH4）2SO4浓度梯度，发现（NH4）2SO4添加量为0.5‰时，对于木霉菌产孢的促进效果最显著，其最大产孢量为8.63×109 个/g。

2.9 MgSO4对GF-10菌株产孢的影响

MgSO4对GF-10菌株产孢的影响，培养7 d后，1‰ MgSO4处理的木霉发酵培养基长势最好，高于此浓度时产孢量呈下降趋势，但均高于对照组，说明MgSO4对于木霉发酵有一定的促进作用，最大产孢量为5.92×109 个/g。

2.10 KH2PO4对GF-10菌株产孢的影响

KH2PO4对GF-10菌株产孢的影响，培养7 d后，0.8%的KH2PO4处理的木霉发酵培养基产孢量最高，说明KH2PO4对于木霉发酵有一定的促进作用，其最大产孢量为1.027×1010 个/g。

2.11 混合矿质元素对GF-10菌株产孢的影响

培养7 d后，1.0%矿质元素处理的木霉发酵培养基产孢量最高，产孢量为7.586×109 个/g，当浓度继续增加时，产孢量则迅速下降，这说明在培养基中添加微量的矿质元素能够促进木霉产孢，而浓度过高则会对影响木霉的正常生长及产孢。

2.12 正交实验

试验结果的极差和方差分析可见（如表2、表3），影响木霉菌产孢的条件顺序为搅拌 > 光照 > KH2PO4 > 葡萄糖 > MgSO4 > （NH4）2SO4  > 混合矿质元素，其中搅拌、光照、KH2PO4对产孢量的影响具有显著意义（P<0.05）。正交实验结果确定混合基质中木霉菌GF-10的最佳发酵工艺为48h搅拌，光照12 h/d，添加0.6%KH2PO4 、5%葡萄糖，1.5%MgSO4 、1.5%（NH4）2SO4 和0.5%的混合矿质元素。根据正交实验结果的最佳发酵条件做验证实验，木霉菌GF-10的最大产孢量为1.25×1010 个/g，比以麸皮为基质的培养条件提高了110.79%[14]。

3 结论与讨论

生防菌的固体发酵过程受培养成分和培养条件的影响[15]，其培养成分中的碳源、氮源、无机盐等，培养条件中的温度、培养基质的酸碱度、培养时间和接种量等因素都会影响到生防菌的产孢率。因此，为了充分发挥生防菌的生产能力，更好地提高其产孢率，需要对影响发酵结果的各种因子进行筛选。

本研究通过单因素筛选，以混合基质为培养基，采用正交实验对长枝木霉GF-10的发酵产孢条件进行了优化，正交实验显示最优值制备的培养基产孢量为1.25×1010 个/g，比前期优化所得的麦麸基质培养基提高110.79%[14]。本实验中，影响木霉菌发酵工艺的主要因素是搅拌、光照、KH2PO4。

木霉菌的发酵过程中会在培养基表面形成菌膜，使得固体基质结团，影响了空气的流动，导致基质内局部缺氧，从而影响微生物的生长[16]。为了防止缺氧现象的发生，通常采用通风、搅拌和翻动等手段来增加氧的传递速率，促进微生物的生长，并防止固体基质的结团[17]。本研究除采用搅拌外，在培养基中加入的竹炭具有多孔结构，增加了培养基的通氧量，进而促进了GF-10的生长及产孢;且竹炭可成为孢子吸附的基质，提升木霉菌的根部定殖能力。除通气对GF-10产孢有影响外，光照和pH对产孢也具有重要作用;光照虽然对菌丝生长影响不明显，但其可明显促进孢子形成[6，18];木霉菌产孢需要一定的pH，KH2PO4不仅可以提供营养元素，同时对培养基pH的调节也具有重要作用[6，18]。总之，本研究不仅提升了木霉菌GF-10在培养基质上的产孢效率，而且改善了该菌在大田的定殖能力，这为该菌的商品化生产和田间应用奠定了基础。

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