RNAi在昆虫基因功能研究中的应用进展

张涛 郅军锐 叶茂

摘 要：RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由小分子dsRNA引起目的基因mRNA序列特异性降解，导致靶标基因沉默或表达量下调的现象。 RNAi在昆虫重要生理酶相关基因功能的研究中起着至关重要的作用。本文主要对RNAi不同方法的应用、各方法的优缺点及影响RNAi效率的因素进行了综述，总结了RNAi不同方法对昆虫功能基因沉默效果的差异，及在昆虫基因功能研究中的应用进展。

关键词：RNA干扰;基因功能;脱靶效应;害虫防治

中图分类号：S476

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）06-0063-07 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.011

昆虫的RNA干扰（RNA interference，RNAi）主要指外源双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的，通过阻碍特定基因的翻译或转录，引起内源靶标mRNA降解，从而导致靶标基因沉默或表达量明显下调的现象[1]。对于揭示昆虫生长发育及抗性相关基因的功能具有不可或缺的作用。近年来，基于昆虫基因组学[2-3]、转录组学[4]、代谢组学[5]、蛋白质组学[6]等分子生物学技术的发展。RNAi自1998年在对秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans进行基因沉默的研究中发现以来[7]，RNAi技术已经被广泛应用于现代农业领域，其应用主要包括作物品种改良、生物防治、昆虫抗药性功能基因研究等方面[1]。精确地说就是应用于基因功能和信号传导通路研究[8]。近年来，RNAi技术在昆虫基因功能方面的研究也是如火如荼，不仅可以用于控制害虫，也可以利用RNAi保护益虫[9]。

RNAi方法自从被发现至今，就备受害虫防治研究领域的学者们青睐。昆虫的RNAi因其具有较强的特异性、对环境相对友好以及高效等特点，在基因功能、抗药性研究和害虫防治等方面的研究不断取得新的进展[10-11]。以模式昆虫黑腹果蝇Drosophila melanogaster基因功能的研究为起点，国内昆虫RNAi研究已涉及常见8大目昆虫[12]，比如半翅目的白背飞虱Sogatella furcifera [13]、鳞翅目的棉铃虫Helicoverpa armigera [14]、直翅目的东亚飞蝗 Locusta migratoria manilensis[15]、双翅目的桔小实蝇Bactrocera dorsalis[16]、鞘翅目的马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata[17]、半翅目的中黑盲蝽Adelphocoris suturalis[18]、膜翅目的蜜蜂Bee[19]。除上述昆虫外，RNAi技术在蜱类和螨类防治中的应用也有一些报道[20-21]。

除上述几个目的昆虫外，欧美等国家对其他类别昆虫的研究也早有报道，比如蜚蠊目[22-24]、等翅目[25-26]、脉翅目[27]、缨翅目的西花蓟马Frankliniella occidentalis[28-29]。除昆虫外，国外对蜱[30]和螨[31-32]也建立了相应的RNAi方法。

由于该技术对靶基因的高特异性、系统性及易操作性等特点，现已成为研究昆虫基因功能的主要生物技术之一，且在害虫防治等领域具有潜在的应用价值[33]，特别是在非模式昆虫中[34]。但不同的RNAi方法对同一昆虫的RNAi效果存在差异，同一RNAi方法用在不同昆虫研究RNAi效率也存在差异。dsRNA的导入方法、脱靶效应、体外合成的dsRNA易降解及高成本等问题是RNAi应用与推广的最大障碍，严重的脱靶效应会导致应用RNAi进行昆虫功能基因组学研究产生错误结论。也会因为靶标非特异性的出现，而导致严重的环境安全性问题，甚至影响人类健康[35]。本文根据近年发表的相关文献对不同RNAi方法在昆虫功能基因研究及害虫防治研究中的应用、以及主要存在的问题等进行综述并展望，以期能为以后昆虫功能基因研究中RNAi方法的选取提供参考。

1 不同RNAi方法在昆虫功能基因研究中的应用

RNAi技术广泛应用于昆虫基因功能研究中，但由于昆虫种类多样性、基因多样性以及RNAi方法多样性等导致靶标基因的沉默效率存在差异[34，37]。其干扰片段dsRNA的导入方法主要有显微注射、喂食、浸泡、病毒感染、共生体介导和转基因方法等，其中较常用的是显微注射法、喂食法和浸泡法[1，36]，且显微注射法是研究昆虫系统性RNAi的最适方法[12]。

1.1 显微注射法

1.1.1 显微注射法在昆虫RNAi研究中的应用

显微注射法即将体外合成的 dsRNA 通过显微注射仪注射到昆虫体內的方法。通常昆虫的各组织部位均可注射，但由于昆虫中肠表皮的微绒毛上含有许多通道和内吞小体、无几丁质包被、较大的表皮面积等特点便于dsRNA的吸收和扩散，所以，通常选择中肠进行注射[38]。

随着显微注射法在模式生物线虫和双翅目黑腹果蝇的RNAi研究中取得成功[7，39]。该方法便在鞘翅目、鳞翅目、膜翅目、半翅目和直翅目等昆虫中得到广范应用，且成为最为有效引入dsRNA主要方法之一[36]。近两年来，显微注射法在昆虫RNAi中的研究可谓是日新月异，Vatanparast 等[40]观察了注射α-淀粉酶基因HaAMY48，Ha-AMY49和保幼激素酯酶基因Ha-JHE的dsRNA后对棉铃虫生长发育的影响，发现注射96 h后3类重要酶基因表达量分别下调95.8%、 97.7%和74%。Zhu等 [41]研究发现对褐飞虱Nilaparvata lugens注射核糖体蛋白L5基因N1RPL5 dsN1RPL5后，其mRNA转录水平显著降低了65.5%，限制了褐飞虱卵巢的发育。此外，豌豆长管蚜Acyrthosiphon pisum[42]，非洲甘薯象甲[43]，大麦虫Zophobas atratus[44]和美洲大蠊Periplaneta americana[45]等昆虫功能基因研究也见诸报端。

在国内也有一些报道，如杨爽等[46]使用显微注射法将麦长管蚜Sitobion avenae Fabricius OBP7的小干扰RNA（siRNA）导入麦长管蚜体内，结果证明了显微注射方式进行RNA干扰的可行性。蒋艳冬等[47]利用显微注射法对白背飞虱Sogatella furcifera触角中特异性高表达的 SfOBP11进行 RNA 干扰，结果显示，注射 SfOBP11 dsRNA 的若虫对寄主水稻的识别能力降低。王芮等[48]采用显微注射技术建立了超量表达灰飞虱 Laodelphax striatellus羧酸酯酶基因的果蝇品系。还有研究发现，对东亚飞蝗采用注射法（触角窝注射和腹部注射）进行RNAi实验，得出触角窝注射法可以高效降解 LmCYP3117C1，可作为飞蝗触角高表达基因RNAi的主要干扰方法[15]。Ren 等[49]发现在飞蝗腹部注射 dsRNA 不能有效地干扰卵巢高表达的基因。熊佳福等[50]显微注射家蝇Musca domestica胚胎，成功建立Ammrjp1转基因家蝇品系，RT-PCR证明Ammrjp1基因在转基因家蝇中可正常转录。

此外，陈洁等[51]对甜菜夜蛾Spodoptera exigua进行RNAi实验，利用注射法，成功沉默了几丁质酶B基因（SeCHSB），导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸形。王锦达[35]在赤拟谷盗Tribolium castaneum RNAi的研究表明注射不同dsRNA均可以有效抑制目标基因的表达量（55%～75%），且能持续抑制超过7天，并导致78.8%～87.0%的试虫畸形。许霁玉[52]对褐飞虱五龄末期若虫进行RNAi实验，得出沉默后虫体内卵黄蛋白基因（N1Vg）的表达量显著降低，卵母细胞发育滞缓，产卵量与孵化率均显著降低，褐飞虱的生殖能力受到一定的影响。Hu等[53]利用RNAi技术研究小菜蛾Plutella xylostella体内细胞色素 P450 基因家族中的CYP321E1 基因，研究表明在CYP321E1 基因在小菜蛾抗药性中起明显作用。

1.1.2 显微注射法优缺点分析

显微注射法具备明显的优点，主要表现在通过显微注射运送ds RNA，能够直接迅速将双链 RNA 运送到目的组织或血淋巴中，避免外表皮、肠道上皮细胞等障碍。此外，能够将确定数量的dsRNA 注射到昆虫体内[36]。而且可以引起强烈的系统性RNAi。该方法可将某些基因干扰效应传递到子代，对于口器、生境和发育历期的要求十分宽泛[11]。

该技术也还存在一些缺陷与不足。如显微注射法操作技巧的要求高，操作参数需优化，操作过程相对耗时，且不适合个体较小的昆虫[1，36]。因为体型较小的昆虫容易被注射操作的机械损伤而导致死亡，不利于实验的进一步开展。然而隨着全细胞自动注射仪等精密仪器的发展，显微注射法在小型昆虫的RNAi研究中取得了一些突破性进展。李如美等[54]利用NK2 全自动细胞注射系统，以烟粉虱Bemisia tabaci的CYP6CM1 基因为目标基因成功构建了RNAi技术体系;Badillo-Vargas等[31]使用Nanoinjector II（Drummond Scientific，Broomall，PA，USA）显微注射仪，以西花蓟马Frankliniella occidentalis的V-ATPase-B为靶标基因进行干扰实验，成功导致V-ATPase-B基因的表达量下调，致使西花蓟马死亡率升高，繁殖率下降。

1.2 饲喂法

1.2.1 饲喂法在昆虫RNAi研究中的应用

饲喂法即昆虫通过取食体外合成的dsRNA/siRNA而对靶标基因起到干扰作用的方法。近几年来应用饲喂法进行昆虫的RNAi研究方兴未艾。Yu和Killiny[55]利用饲喂法对亚洲柑橘木虱Diaphorina citri的谷胱甘肽S-转移酶DcGSTe2、DcGSTd1基因进行沉默，导致该虫对甲氰菊酯和噻虫嗪的敏感性增加，且通过对柑橘木虱饲喂dsRNA（dsDcGSTe2-d2）对DcGSTe2和DcGSTd1进行共沉默，导致了柑橘木虱对甲氰菊酯和噻虫嗪的敏感性增加。Niu等[56]利用植物介导的dsRNA饲喂西方玉米根虫Diabrotica virgifera virgifera导致该虫繁殖率显著下降。Wang等[57]用合成的dsRNA喂养烟粉虱成虫导致Btdef基因沉默从而降低了烟粉虱体内TYLCCNV基因的表达丰度。Ran等[58]在研究大豆食心虫Leguminivora glycinivorella免疫相关基因LgToll-5-1a和LgPGRP-LB2a时，利用饲喂法导致这两个基因表达水平下调，导致其发育受阻且死亡率升高。Ghosh和Gundersen-Rindal[59]用细菌表达和体外合成的dsRNA喂养舞毒蛾Lymantria dispar幼虫，导致舞毒蛾体重下降、卵块数减少一半。

李雪峰等[60]利用豌豆蚜Acyrthosiphon pisum基因C002序列进行RNAi试验，结果显示，麦长管蚜分别取食dsC002 4 d和6 d后，C002基因的表达量均下降，且差异极显著。李晓敏等[61]对B型和Q型烟粉虱饲喂P450CYP6CM1dsRNA，研究结果表明P450CYP6CM1基因在烟粉虱抵御烟碱或新烟碱类杀虫剂过程中起重要作用。此外，饲喂法在豌豆长管蚜[42]、非洲甘薯象甲[43]、棉铃虫[62]、冈比亚按蚊Anopheles gambiae [63]、东亚飞蝗[15]等昆虫中的研究也已见诸报端。

1.2.2 饲喂法导入dsRNA的方式及优缺点分析

前人的研究报道指出饲喂法导入dsRNA的方法主要分为3种[1，36]：第1种是在细菌中表达双链RNA，通过喂食细菌实现的，Palli用大肠杆菌表达甜菜夜蛾几丁质合成酶A（Se CHSA） 的dsRNA，并混在人工培养基后喂食甜菜夜蛾，可成功将dsRNA传送到幼虫的中肠[64];第2种是在体外合成dsRNA，再把dsRNA混在食物或溶液直接给昆虫食用，在赤拟谷盗、豌豆蚜、烟草天蛾Manduca sexta、马铃薯甲虫的研究中取得成功[1，65];第3种是喂食能够表达双链RNA 的转基因植物，目前利用转基因植物抑制昆虫基因表达，在鳞翅目、鞘翅目和半翅目昆虫中得以成功实现[9]，且通过使昆虫取食表达 dsRNA 的植物来沉默体内目的基因，从而达到防控虫害的目的[66]，该方法是将RNAi技术向大田推广应用最具潜力方法之一。

饲喂法用于昆虫dsRNA导入具有省力、省时和易操作等优点[67]。对于高通量基因的筛选，特别是害虫的防治，饲喂法相比于其他方法应用性更强，且对于个体比较小的昆虫不易对其造成机械损伤，如王晖等[68]用饲喂法成功沉默麦长管蚜与桃蚜Myzus persicae细胞色素P450基因。但饲喂法也存在不足，主要表现为不同物种所需量的范围不同，需要大量的实验进行验证。且饲喂法由于作用较慢、效率较低、昆虫的胚胎期和蛹期等无法取食等特点，并非所有的种都能取得成功[11，36]。

1.3 其他方法及其应用

除上述两种较常用方法外，其他还有如浸泡法、病毒介导法、转基因法等dsRNA导入手段。浸泡法是将实验材料直接浸泡在dsRNA 溶液中而引起RNAi的方法，因其方便操作，也变得越来越常见，这种方法也称为细胞外RNAi[36]。浸泡法在昆虫细胞系研究中应用广泛，在昆虫当中，大部分浸泡实验主要在细胞株中实施[69]，如黑腹果蝇[70]和飞蝗[15]。

病毒介导法是将靶标基因dsRNA通过病毒侵染途径导入宿主体内的方法。针对不同的目标害虫，需对其生活史、生活习性和发生规律进行全面了解，有目的地选择适宜的方法进行干扰试验，以获得预期效果[71];转基因法进行 RNAi的优点在于可持续、稳定和便利地得到 dsRNA，并且能够遗传，转基因方法首先被应用于果蝇上，通过表达双链RNA的转基因植物，将昆虫基因作为靶标，提高植物的抗虫性[11，36，71]。此外，Whitten等[32]利用共生体介导的方法对西花蓟马进行RNA干扰，导致西花蓟马通道蛋白的mRNA表达水平下降，致使其对寄主植物的取食为害减弱，死亡率增高。

2 影响RNAi效率的因素

2.1 脱靶效应

RNAi脱靶效应首先是在研究人体细胞内siRNA引导的基因沉默现象中发现的，该研究结果显示，沉默的并非靶标基因，而是与siRNA的11个连续核苷酸序列匹配的非靶标基因[72]。对于昆虫的脱靶效应而言，前人在对黑腹果蝇的研究中得出，dsRNA与mRNA的匹配长度超过19 bp后就会产生较高的假阳性结果[73，74]。而对于秀丽隐杆线虫则是dsRNA与mRNA大于40 bp且相似性高于95%才会出现脱靶效应。

脱靶效应的类型根据其是否引起细胞的一序列免疫应答等原因将其分为两类，分为序列相关和序列无关，其中序列相关脱靶效应包括：（1）siRNA分子和非鞭標基因的互作;（2）siRNA的种子区域六聚体或七聚体与非靶标基因3UTR区的匹配。序列无关的脱靶效应包括：（1）外源siRNA引起内源mircoRNA对细胞内非靶标基因的调节作用;（2）外源dsRNA诱导机体或细胞产生免疫应答;（3）靶基因沉默，进而改变下游基因的表达即‘下游效应。王锦达[35]对赤拟谷盗注射dsRNA（dsEGFP）后对其15个免疫应答相关基因检测，结果表明，可以通过免疫反应引发赤拟谷盗序列无关基因产生脱靶效应。

RNAi脱靶效应的产生与siRNA/dsRNA的浓度有关，针对不同的物种不同的靶标基因设计适宜浓度及适合长度的siRNA/dsRNA，有益于降低脱靶现象的出现率;通过化学修饰的方法亦可减少脱靶情况的出现，化学修饰通过使正义链失活，失去与RISC结合的能力，从而降低正义链引发的脱靶效应。此外，通过混合siRNA/dsRNA进行干扰比单一转染的siRNA或者dsRNA更能降低脱靶效应[35]。

2.2 功能性靶标基因的选择

将 RNAi 应用于害虫防控领域，功能性靶标基因的选择极为重要，这些基因包括生长发育相关基因、昆虫能量代谢相关的重要生理酶基因、生长发育相关的激素、神经调控相关的蛋白等。就当前已有的研究报道而言，昆虫抗药性相关功能基因的研究更为全面。例如，Fishilevich 等[75]沉默了西方玉米根虫和新热带区的褐蝽Euschistus heros 染色质重组 ATP 酶基因，结果显示西方玉米根虫和新热带区的褐蝽繁殖率显著降低。王晖等[68]沉默了麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素 P450，结果随着 dsRNA 浓度的增大和时间的推移，麦长管蚜和桃蚜的死亡率可分别达到 75.56%和 64.44%。

在昆虫RNAi的研究中，选择合适的靶基因和适当的导入方法是其成功的关键。根据齐江卫等[76]的报道，在害虫的防治中可供选择适宜靶标基因主要有4类，分别为（1）害虫致死基因，如Rieske铁流蛋白基因沉默致使害虫死亡;（2）害虫抗性和免疫基因，如细胞色素P450;（3）害虫生长发育相关基因，如几丁质酶相关基因、乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽S-转移酶等[55，76];（4）害虫产卵相关基因，如卵黄原蛋白受阻使害虫产卵量下降[77]。

2.3 dsRNA的设计及其它影响因素

设计科学合理的dsRNA是保证昆虫RNAi取得良好效果的关键，因为只有适宜dsRNA进入虫体后才能诱导产生RNA干扰反应[11]。dsRNA对RNA干扰效率的影响可归纳为以下几点：（1）dsRNA的序列，决定生物出现脱靶效应的可能性;（2）dsRNA的长度，决定了吸收和沉默的效率;（3）dsRNA的浓度，浓度越高不一定沉默效应越强。比如在赤拟谷盗的RNA干扰研究中，在相同dsRNA浓度下，520 bp的dsRNA比69 bp的dsRNA抑制靶标基因表达的持续时间长63 d[78]。

此外，dsRNA不稳定性、供试昆虫的发育历期、肠道内含物、生理PH、dsRNases、RNAi通路重叠等都对RNAi效率存在不同程度的影响[79]。就昆虫的发育历期而言，尽管较大的龄期便于操作，但幼龄时期往往表现出更强的沉默效应，且不同基因的沉默效应持续时间不同[11，79]。

3 小结与展望

随着昆虫基因组学、转录组学、新一代高通量测序技术等分子生物学技术的进一步发展，为我们获取大量的基因信息提供了技术保障。RNAi 作为一种对基因表达具有特异性的抑制机制，为未知基因功能的研究提供了技术平台，成为研究基因功能的有利工具。同时 RNAi 技术具有简单、快速、重复性好等特性，可成为研究细胞信号传导通路的新策略。不同RNAi方法对同一昆虫的干扰效应存在差异，比如前人研究发现浸泡法和涂抹法干扰飞蝗触角的LmCYP3117C1基因效果不明显，腹部注射法对飞蝗触角 LmCYP3117C1 的沉默效率相对较低，唯有触角窝注射法可以高效降解LmCYP3117C1，及注射法可作为飞蝗触角高表达基因RNAi的主要干扰方法[15]。

目前，昆虫RNAi 技术在昆虫重要生理酶、生长发育、抗药性及其滞育相关功能基因方面的研究已取得重要进展。然而在实际应用中还存在一些棘手的问题。如 siRNA 不仅可与靶标基因特异性结合，也可与非靶标基因结合使其基因沉默，出现脱靶效应;如何使用特定的RNAi来保护植物免受害虫侵害，但又不伤害以这些植物为食的其他物种？不同种或同种昆虫的同一靶标基因或不同靶标基因，RNAi效率最好所需的dsRNA浓度？如何将RNAi技术应用于田间害虫的防治？如何保障饲喂法研究中体外合成的dsRNA不降解或者少降解等均是亟待解决的关键科学问题。RNAi 技术的研究应用，可为害虫的防控策略提供一种更可持续、更绿色环保的新思路，相信随着对分子生物学研究的不断深入，RNAi技术有望走出实验室，向田间推广应用。

参 考 文 献：

[1] 王伟伟，刘 妮，陆 沁，等.RNAi技术的最新研究进展[J].生物技术通报，2017，33（11）：35-40.

[2] 张传溪.中国农业昆虫基因组学研究概况与展望[J].中国农业科学，2015，48（17）：3454-3462.

[3] 彭 露，何玮毅，夏晓峰，等.基因组学时代害虫治理的研究进展及前景[J].应用昆虫学报，2015（1）：1-22.

[4] 张棋麟，袁明龙.基于新一代测序技术的昆虫转录组学研究进展[J].昆虫学报，2013，56（12）：1489-1508.

[5] Xu Y J，Luo F，Gao Q，et al.Metabolomics reveals insect metabolic responses associated with fungal infection[J].Analytical & Bioanalytical Chemistry，2015，407（16）：4815-4821.

[6] 陈利珍，梁革梅，吴孔明，等.蛋白质组学技术的发展及其在昆虫中的应用[J].昆虫学报，2008，51（8）：868-875.

[7] Fire A，Xu S Q，Montgomery M K，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391（6669）：806-811.

[8] 冯小艳，张树珍.RNAi作用機制及应用研究进展[J].生物技术通报，2017，33（5）：1-8.

[9] 闸雯俊，李三和，周 雷，等.RNAi技术控制害虫的机制与应用[J].现代农业科技， 2017（7）：144-145.

[10] 杨中侠，文礼章，吴青君，等.RNAi技术在昆虫功能基因研究中的应用进展[J].昆虫学报，2008，51（10）：1077-1082.

[11] 赵 洁，刘小宁. RNAi在昆虫控制领域的研究进展[J].中国植保导刊，2015，35（1）：17-23.

[12] 施秀珍，吴青君，王少丽，等.RNA干扰在昆虫中的作用机理及应用进展[J].生物安全学报，2012，21（3）：229-235.

[13] 陈 静，张道伟，钱正敏.白背飞虱几丁质合成酶1基因的结构及特性研究[J].生物技术通报，2018（1）：195-201.

[14] 公玲玲，张丹丹，郑曰英，等.棉铃虫ABC转运蛋白ABCG1的基因克隆、亚细胞定位及其与Cry1Ac毒力的关系[J].昆虫学报，2017，60（3）：297-308.

[15] 史学凯，张艺伟，朱坤炎，等.不同RNAi方法对飞蝗触角高表达基因沉默效率的比较[J].应用昆虫学报， 2017（5）：780-790.

[16] 胡 浩.桔小实蝇注射法RNAi效率提升方法的研究[D].重庆：西南大学，2017.

[17] 杨 帅，付开赟，吴家和，等.马铃薯甲虫两个系统性RNA干扰缺失基因cDNA的克隆、序列分析和时空表达[J].应用昆虫学报，2016，53（2）：347-356.

[18] 罗 静.中黑盲蝽信息素合成相关基因的筛选及功能分析[D].武汉：华中农业大学，2017.

[19] 吴艳艳，周 婷. RNA干扰在蜜蜂病害防治中的应用[J].中国蜂业，2013（16）：58.

[20] 崔 杰，周金林.蜱RNA干扰的不同方法与应用[J].寄生虫与医学昆虫学报，2015（1）：65-71.

[21] 敖已倩云，申光茂，王夢瑶，等.朱砂叶螨β-COP和Sro基因鉴定及其沉默致死效果[J].中国农业科学，2017，50（18）：3529-3539.

[22] Cruz J，Mané-Padrós D，Bellés X，et al.Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo[J].Developmental Biology，2006，297（1）：158-171.

[23] Maestro J L，Bellés X.Silencing allatostatin expression using double-stranded RNA targeted to preproallatostatin mRNA in the German cockroach[J].Archives of Insect Biochemistry & Physiology，2006，62（2）：73-79.

[24] Pueyo J I，Lanfear R，Couso J P.Ancestral Notch-mediated segmentation revealed in the cockroach Periplaneta americana[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（43）：16614-16619.

[25] Zhou X，Wheeler M M，Oi F M，et al.RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA[J].Insect Biochemistry & Molecular Biology，2008，38（8）：805-815.

[26] Hamilton C，Bulmer M S.Molecular antifungal defenses in subterranean termites：RNA interference reveals in vivo roles of termicins and GNBPs against a naturally encountered pathogen[J].Developmental & Comparative Immunology，2012，36（2）：372-377.

[27] Konopova B，Jindra M.Broad-Complex acts downstream of Met in juvenile hormone signaling to coordinate primitive holometabolan metamorphosis[J].Development，2008，135（3）：559-568.

[28] Badillo-Vargas I E，Rotenberg D，Schneweis B A，et al.RNA interference tools for the western flower thrips，Frankliniella occidentalis[J].Journal of Insect Physiology，2015（76）：36-46.

[29] Whitten M M A，Facey P D，Sol R D，et al.Symbiont-mediated RNA interference in insects[J].Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences，2016，283（1825）：20160042.

[30] Kocan K M，Zivkovic Z，Blouin E F，et al.Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis[J].Bmc Developmental Biology，2009，9（1）：42-53.

[31] Kamau L M，Wright H W，Nisbet A J，et al.Development of an RNA-interference procedure for gene knockdown in the poultry red mite，Dermanyssus gallinae：Studies on histamine releasing factor and Cathepsin-D[J].African Journal of biotechnology，2013（12）：1350-1356.

[32] Kwon D H，Park J H，Lee S H.Screening of lethal genes for feeding RNAi by leaf disc-mediated systematic delivery of dsRNA in Tetranychus urticae[J].Pesticide Biochemistry & Physiology，2013，105（1）：69-75.

[33] Li T，Liu L，Zhang L，et al.Role of G-protein-coupled receptor-related genes in insecticide resistance of the mosquito，Culex quinquefasciatus[J].Scientific Reports，2014，4（39）：6474-6483.

[34] Terenius O，Papanicolaou A，Garbutt J S，et al.RNA interference in Lepidoptera：an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design.[J].Journal of Insect Physiology，2011，57（2）：231-245.

[35] 王錦达.赤拟谷盗RNAi及dsRNA脱靶效应的研究[D].南京：南京农业大学，2015.

[36] 刘吉升，朱文辉，廖文丽，等.昆虫RNA干扰中双链RNA的转运方式[J].昆虫学报，2016，59（6）：682-691.

[37] Scott J G，Michel K，Bartholomay L C，et al.Towards the elements of successful insect RNAi.[J].Journal of Insect Physiology，2013，59（12）：1212-1221.

[38] Hakim R S，Baldwin K，Smagghe G.Regulation of midgut growth，development，and metamorphosis[J].Annual Review of Entomology，2010，55（1）：593-608.

[39] Kennerdell J R，Carthew R W.Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway[J].Cell，1998，95（7）：1017-1026.

[40] Vatanparast M，Kazzazi M，Mirzaieasl A，et al.RNA interference-mediated knockdown of some genes involved in digestion and development of Helicoverpa armigera.[J].Bulletin of Entomological Research，2017，107（6）：777-790.

[41] Zhu J，Hao P，Lu C，et al.Expression and RNA interference of ribosomal protein L5 gene in Nilaparvata lugens （Hemiptera：Delphacidae）[J]. Journal of Insect Science，2017，17（3）：1-8.

[42] Christiaens O，Swevers L，Smagghe G.DsRNA degradation in the pea aphid （Acyrthosiphon pisum） associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay[J].Peptides，2014（53）：307-314.

[43] Prentice K，Christiaens O，Pertry I， et al.RNAi-based gene silencing through dsRNA injection or ingestion against the African sweet potato weevil Cylas puncticollis （Coleoptera：Brentidae）[J].Pest Management Science，2017，73（1）：44-52.

[44] Wang K，Peng Y，Pu J，et al.Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo[J].Insect Biochemistry & Molecular Biology，2016（77）：1-9.

[45] 王 燕，李大琪，刘晓健，等.飞蝗表皮蛋白 Obstructor 家族基因的分子特性及基于 RNAi 的功能分析[J].中国农业科学，2015，48（1）：73-82.

[46] 杨 爽，尹 姣，曹雅忠，等.麦长管蚜OBP7基因的RNA干扰[J].植物保护，2015，41（3）：104-109.

[47] 蒋艳冬，梁庆梅，白月亮，等.白背飞虱气味结合蛋白SfOBP11与寄主选择行为的相关性研究[J].应用昆虫学报，2016，53（3）：463-471.

[48] 王 芮，张浩淼，邓 蕾，等.灰飞虱羧酸酯酶LsCarE1介导杀虫剂抗性[J].昆虫学报，2017，60（9）：1006-1012.

[49] Ren D，Cai Z，Song J，et al.dsRNA uptake and persistence account for tissue-dependent susceptibility to RNA interference in the migratory locust，Locusta migratoria[J].Insect Molecular Biology，2014，23（2）：175-184.

[50] 熊佳福，张鉴清，刘桂清，等.利用PiggyBac系统在家蝇中表达蜜蜂王浆蛋白MRJP1[J].环境昆虫学报，2017，39（1）：75-84.

[51] 陈 洁，陈宏鑫，姚 琼，等.甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究[J].中国农业科学，2014，47（7）：1351-1361.

[52] 许霁玉.褐飞虱RNAi——防治候选靶标——2个雌性特异基因的分析[D].杭州：浙江大学，2016.

[53] Z H，Q L，H C，et al.Identification of a novel cytochrome P450 gene，CYP321E1 from the diamondback moth，Plutella xylostella （L.） and RNA interference to evaluate its role in chlorantraniliprole resistance[J].Bulletin of Entomological Research，2014，104（6）：716-723.

[54] 李如美，王少丽，张友军.显微注射构建烟粉虱的RNAi技术体系[J].应用昆虫学报，2015，52（2）：504-509.

[55] Yu X，Killiny N.RNA interference of two glutathione S-transferase genes，DcGSTe2 and DcGSTd1，increases the susceptibility of Asian citrus psyllid （Hemiptera：Liviidae） to the pesticides，fenpropathrin and thiamethoxam[J].Pest Management Science，2018，74（3）：638-647.

[56] Niu X，Kassa A，Hu X，et al.Control of western corn rootworm （Diabrotica virgifera virgifera） reproduction through plant-mediated RNA interference[J].Sci Rep，2017，7（1）：12591-12604.

[57] Wang Z Z，Bing X L，Liu S S，et al.RNA interference of an antimicrobial peptide，Btdef，reduces Tomato yellow leaf curl China virus accumulation in the whitefly Bemisia tabaci[J].Pest Management Science，2017，73（7）：1421-1427.

[58] Ran R，Li T，Liu X，et al.RNA interference-mediated silencing of genes involved in the immune responses of the soybean pod borer Leguminivora glycinivorella （Lepidoptera：Olethreutidae）[J].Medicine，2018，96（24）：e7189.

[59] Ghosh S K B，Gundersen-Rindal D E.Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth，Lymantria dispar （Lepidoptera：Erebidae）[J].European Journal of Entomology，2017，114（1）：170-178.

[60] 李雪峰，范 佳，孫永伟，等.麦长管蚜唾液蛋白C002的基因克隆与RNA干扰研究[J].应用昆虫学报，2014，51（6）：1479-1487.

[61] 李晓敏.利用液体饲囊技术比较B和Q型烟粉虱的取食行为和RNA干扰效果[D].郑州：河南农业大学，2013.

[62] Mao Y B，Cai W J，Wang J W，et al.Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol[J].Nature Biotechnology，2007，25（11）：1307-1313.

[63] Zhang J，Khan S A，Hasse C，et al.Pest control.Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids[J].Science，2015，347（6225）：991-994.

[64] Palli S R.RNA interference in Colorado potato beetle：steps toward development of dsRNA as a commercial insecticide[J].Current Opinion in Insect Science，2014（6）：1-8.

[65] Zhang H，Li H，Guan R，et al.Lepidopteran insect species-specific，broad-spectrum，and systemic RNA interference by spraying dsRNA on larvae[J].Entomologia Experimentalis Et Applicata，2015，155（3）：218-228.

[66] Baum J A，Bogaert T，Clinton W，et al.Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J].Nature Biotechnology，2007，25（11）：1322-1326.

[67] Tian G，Cheng L，Qi X，et al.Transgenic cotton plants expressing double-stranded RNAs target HMG-CoA reductase （HMGR） gene inhibits the growth，development and survival of Cotton Bollworms[J].International Journal of Biological Sciences，2015，11（11）：1296-1305.

[68] 王 晖.利用RNAi技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素P450[D].西安：西北农林科技大学，2012.

[69] Zhou R，Mohr S，Hannon G J，et al.Inducing RNAi in Drosophila cells by transfection with dsRNA[J].Cold Spring Harbor Protocols，2013，2013（5）：461.

[70] Shah C，Frstemann K.Monitoring miRNA-mediated silencing in Drosophila melanogaster S2-cells[J].BBA - Gene Regulatory Mechanisms，2008，1779（11）：766-772.

[71] 杨 广，尤民生，赵伊英，等.昆虫的RNA干扰[J].昆虫学报，2009，52（10）：1156-1162.

[72] Jackson A L，Burchard J，Schelter J，et al.Widespread siRNA “off-target” transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity[J].Rna-a Publication of the Rna Society，2006，12（7）：1179-1187.

[73] Kulkarni M M，Booker M，Silver S J，et al.Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays[J].Nature Methods，2006，3（10）：833-838.

[74] Ma Y，Creanga A，Lum L，et al.Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens[J].Nature，2006，443（7109）：359-363.

[75] Fishilevich E，V Lez A M，Khajuria C，et al.Use of chromatin remodeling ATPases as RNAi targets for parental control of western corn rootworm （Diabrotica virgifera virgifera） and Neotropical brown stink bug （Euschistus heros）[J].Insect Biochemistry & Molecular Biology，2016（71）：58-71.

[76] 齐江卫，龚 亮，王会冬，等.RNAi及其在害虫防治中的应用[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2014，42（7）：148-156.

[77] 严 盈，彭 露，万方浩.昆蟲卵黄原蛋白功能多效性：以蜜蜂为例[J].昆虫学报，2010，53（3）：335-348.

[78] Miller S C，Miyata K，Brown S J，et al.Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum：Parameters affecting the efficiency of RNAi[J].Plos One，2012，7（10）：e47431.

[79] Cooper A，Silver K，Jianzhen Z，et al.Molecular mechanisms influencing efficiency of RNA interference in insects [J].Pest Management Science，2018，75（1）：18-28.