云南地区猪毕氏微孢子虫的分子检测及其基因型鉴定

石莲琴 翟国莲 吴杰 李朝 赵国洪 邹丰才

摘要：【目的】从寄生虫角度明确猪场发生猪腹泻的主要病原体，为防控云南规模化猪场毕氏微孢子虫感染提供理论依据。【方法】通过巢式PCR对云南玉溪和保山地区4个猪场的129份猪粪样本进行猪毕氏微孢子虫检测，扩增微孢子虫的ITS序列，经测序分析和构建系统发育进化树确定其基因型。【结果】129份猪粪样中有30份感染毕氏微孢子虫，感染率为23.26%；其中，云南保山地区的猪毕氏微孢子虫感染率为56.82%（25/44），玉溪地区的感染率为5.88%（5/85），二者差异极显著（P<0.01，下同）。按不同发育阶段划分，发现以仔猪的毕氏微孢子虫感染率最高（76.92%），成年猪的感染率相对较低（11.39%），感染率在不同发育阶段间差异极显著。经测序分析发现共有6个基因型，包括5个已知基因型[CHC5（n=3）、CHG19（n=7）、EbpD（n=9）、EbpA（n=2）和EbpC（n=4）]，1个新的基因型YNZ1（n=5）；从基于微孢子虫ITS序列同源性构建的系统发育进化树可知，检测出的6种基因型均属于Group 1，即具有人兽共患的可能性。【结论】云南猪场普遍存在毕氏微孢子虫感染，且均属于具有人兽共患可能性的基因型。因此，要重点加强猪场微孢子虫的防控工作，养殖过程中产生的粪便等养殖污染物必须经过堆肥发酵或消毒处理后才能作为农家肥使用或排入污水中。

关键词： 猪；微孢子虫；ITS序列；基因型；云南

中图分类号： S858.28 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1654-06

0 引言

【研究意义】微孢子虫（Microsporidian）广泛分布于自然界，是一种重要的人兽共患寄生原虫，可感染包括猪在内的多种家畜及人类（杜海利，2013）。微孢子虫感染以引起宿主腹痛和腹泻为主，其致病机理为成熟孢子在肠绒毛上皮细胞内大量繁殖，从而导致肠绒毛缩短且表面积减小，引起寄主吸收不良，有时还伴有腹泻症状（Franzen and Müller，1999）。微孢子虫感染主要呈隐性感染状态，对于幼畜来说极易引起吸收不良而影响其生长发育，对于免疫缺陷的动物则多因严重腹泻而脱水死亡。微孢子虫可寄生于人体肺脏、胆管和肝脏等器官，引起肺部感染、胆囊炎和肝炎等；还可感染眼部，引起结膜炎等（杜海利，2013）。由于不同宿主所感染的微孢子虫基因型不同，且不同基因型对宿主的致病性也存在明显差异（Santín and Fayer，2009），因此，獲悉当地宿主所感染微孢子虫的基因型信息，对防控微孢子虫病具有重要的公共卫生学意义。【前人研究进展】目前已鉴定的微孢子虫基因型超过200个，据统计超过90%的微孢子虫病是由毕氏微孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）所引起（Zhang et al.，2016）。由于毕氏微孢子虫的核糖体内部转录间隔区（ITS）序列在不同分离株间多态性较强，依据ITS序列差异对毕氏微孢子虫进行基因分型已成为当前公认的标准方法（Santín and Fayer，2009）。现已证实微孢子虫包括160个属1400多个种，其中有8个属14个种具有人兽共患特性（Mathis et al.，2005；杜帅之等，2016），包括毕氏微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、海伦脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫等。在我国，关于奶牛、绵羊、山羊和猪等家畜感染微孢子虫的案例已有报道。Zhang等（2011）从我国流行的肠道细胞虫病中鉴定出12个毕氏微孢子虫基因型，其中10个为新基因型。杜海利（2013）首次对河南省部分地区猪、羊的毕氏微孢子虫病流行情况进行调查，发现感染猪、羊的毕氏微孢子虫与分离自人类的3个基因型毕氏肠微孢子虫同源性高达100%，即猪源、羊源毕氏肠微孢子虫具有人兽共患风险。Jiang等（2015）以我国东北部多个城市的489头绵羊和537头牛的粪便标本为研究对象，通过PCR和ITS测序对肠道细胞虫病的流行和遗传特征进行分析，发现了9个已知基因型（BEB4、BEB6、CM7、CS-4、EBPC、G、I、J和OEB1）和11个新基因型（NESH1～NESH6和NECA1～NECA5），其中近70%绵羊毕氏微孢子虫感染病例是由人类致病基因型BEB6、CS-4和EBPC所贡献。万强（2016）从我国东北5个地级城市563份非腹泻猪的粪便样本中检测到267份毕氏肠微孢子虫，鉴定出11个已知毕氏肠微孢子虫基因型和1个新基因型（CS-10），其中，Ebp C、O、CS-4、Ebp A、Henan-IV和Pig EBITS5为人兽共患基因型。刘婷丽等（2017）采用基于微卫星（MS1、MS3和NS7）和小卫星（MS4）位点的多位点序列分型技术对陕西省部分地区不同用途山羊的毕氏肠微孢子虫分离株进行多位点序列分型研究，结果显示在MS1、MS4和MS7位点的扩增效率依次为27.9%、18.0%和50.8%，而在NS3位点所有样品均未获得有效扩增。【本研究切入点】云南部分养猪场普遍存在猪腹泻情况，通过诊断检测已排除病毒和细菌感染，因此需从寄生虫角度明确这些猪场发生猪腹泻的主要病原体，但至今关于云南地区猪毕氏微孢子虫感染的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】通过巢式PCR对云南玉溪和保山地区4个猪场进行猪毕氏微孢子虫检测，明确导致猪腹泻的主要病原体及其基因型，为防控云南规模化猪场毕氏微孢子虫感染提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

2016年11月～2017年1月，分4次在云南玉溪和保山地区4个猪场采集129份猪粪样本，其中85份来自云南玉溪地区、44份来自云南保山地区。

1. 2 DNA提取

取约2.0 g粪样加水混匀，除去杂质，3000 r/min离心3 min，收集沉淀。吸取250.0 μL沉淀，参照DNA提取试剂盒[Stool DNA Kit（200），OMEGA公司]说明提取DNA，-20 ℃保存备用。

1. 3 ITS序列扩增

采用巢式PCR扩增猪微孢子虫ITS序列，扩增引物参照Yue等（2017）的方法进行设计合成，引物序列如表1所示。PCR扩增分两轮进行，反应体系均为25.0 μL。第一轮：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环72 ℃延伸10 min。第二轮：扩增程序与第一轮相同，目标片段390 bp左右。以2%琼脂糖凝胶电泳检测第二轮巢式PCR产物，阳性PCR产物送至深圳华大基因科技有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对，校正后提交至GenBank数据库。

1. 4 统计分析

分别按地区和年龄划分计算猪毕氏微孢子虫感染率，采用SPSS 22.0和SAS 9.1进行卡方检验，并以MEGA 6.0构建毕氏微孢子虫系统发育进化树。

2 结果与分析

2. 1 猪毕氏微孢子虫的感染情况

检测结果表明，129份猪粪样中有30份感染毕氏微孢子虫，感染率为23.26%。图1为部分猪粪样本的毕氏微孢子虫ITS序列PCR扩增电泳结果。经深圳华大基因科技有限公司测序共获得6种不同的ITS序列，片段大小分别为320、306、320、320、320和316 bp，校正后提交至GenBank数据库，依次获得序列号MG694551、MG694549、MG694552、MG694544、MG694547和MG694550。

2. 2 不同地区和不同发育阶段猪群的毕氏微孢子虫感染率

云南保山地区的猪毕氏微孢子虫感染率为56.82%（25/44），玉溪地区的感染率为5.88%（5/85），二者差异极显著（P<0.01，下同）。按不同发育阶段划分，发现以仔猪（1～3月龄）的毕氏微孢子虫感染率（76.92%）最高，成年猪（>12月龄）的感染率相对较低（11.39%），感染率在不同发育阶段间差异极显著（表2）。

2. 3 云南猪源毕氏微孢子虫的基因型特征

通过测序获得6种不同的毕氏微孢子虫ITS序列即为6个基因型，其对应的核苷酸差异如图2和表3所示。测得的6个基因型中，有5个是已知基因型[CHC5（n=3）、CHG19（n=7）、EbpD（n=9）、EbpA（n=2）和EbpC（n=4）]，1个为新的基因型YNZ1（n=5）。经BLAST比对分析，发现6个基因型中存在7个多态位点，其中YNZ1基因型和CHC5基因型的亲缘关系最近，只是碱基位点在第143位的G替换成T，同源性为99%；YNZ1基因型与EbpA基因型的碱基差异最明显，存在5个基因位点差异，分别位于第93、157、197、203、205和258位。

2. 4 系统发育进化分析结果

将6个云南猪源毕氏微孢子虫ITS序列（MG694

551、MG694549、MG694552、MG694544、MG694547和MG694550）与GenBank上已报道的其他微孢子虫基因型进行同源性比对分析，结果发现其同源性在84.7%～99.7%（图3）。基于ITS序列的同源性，采用MEGA 6.0构建系统发育进化树（图4），结果显示，MG694549、MG694552、MG694544、MG694547和MG694550处于同一个分支上，同属于Group 1的1d亚组；而MG694551与AF348471、AF267145和EF139198位于同一个分支，属于Group 1的1e亚组。

3 讨论

微孢子虫宿主范围广泛，可感染人类、家畜及灵长目、肉食目、偶蹄目和啮齿目的野生动物（王利勤等，2017）。自Deplazes等（1996）首次在瑞士报道猪毕氏微孢子以来，世界多个地区均有猪群感染的报道，感染率为8.3%～94.0%，且呈明显的地域差异（Li et al.，2014a）。本研究通过检测云南规模化猪场的微孢子虫感染情况，结果显示云南玉溪和保山地区的猪微孢子虫感染率为23.29%，与河南的猪微孢子虫感染率（25.90%）（杜海利，2013）相近，但低于我国东北地区的猪微孢子虫感染率（47.43%）（万强，2016），其原因可能是季节、饲养环境和地理条件的不同所造成。

本研究调查结果显示，云南玉溪和保山地区的猪均被毕氏微孢子虫感染，且存在明显的地域差异，可能是由于发育阶段不同所导致。按不同发育阶段划分，发现以仔猪（1～3月龄）的毕氏微孢子虫感染率（76.92%）最高，成年猪（>12月龄）的感染率相对较低（11.39%），感染率在不同发育阶段间差异极显著。由于采自云南保山地区的粪便样品主要是仔猪和育肥猪，导致云南保山地区的猪毕氏微孢子虫感染率极显著高于玉溪地区的感染率。毕氏微孢子虫属于机会性致病寄生虫，猪的年龄越小，其免疫力相对较弱，抵抗力较差，因此感染概率越高。毕氏微孢子虫常与隐孢子虫和贾第虫共同被检出（徐海玲，2016），即毕氏微孢子虫可与其他两种寄生虫共同感染，也可单独感染。对于成年动物来说，毕氏微孢子虫感染后常呈隐性感染状态，不表现出明显的腹泻症状，但排出的粪便是仔猪感染的主要污染源。

本研究通过对30个猪源毕氏微孢子虫ITS序列進行测序分析，共发现6个基因型，其中5个为已知基因型（CHC5、CHG19、EbpD、EbpA和EbpC）（Karim et al.，2015），1个为新的基因型（YNZ1）。CHG19和EbpD是云南保山地区猪源毕氏微孢子虫的两个主要基因型，EbpC为云南玉溪地区的主要基因型，YNZ1基因型也分离自云南保山地区，说明云南保山地区的猪源微孢子基因型较云南玉溪地区更丰富。EbpA、EbpC和EbpD等均为已知的人类致病基因型，同时在猪等家畜中也有感染报道（Li et al.，2014b）。尤其是毕氏微孢子虫可在水中生存，猪群中最常检测到的D、EbpA和EbpD等基因型也是水源中常见的基因型。此外，在毕氏微孢子虫ITS序列的种系发育进化研究中，将已发现的200多个基因型分为8个种群（Group 1～Group 8），其中，Group 1为人兽共患的基因型（李威等，2016；Ma et al.，2017），Group 2～ Group 8中的基因型宿主范围相对较窄，具有宿主特异性，尚未表现出明显的公共卫生安全危害。本研究基于微孢子虫ITS序列同源性构建系统发育进化树，发现检测出的6个基因型均属于Group 1，即具有人兽共患的可能性。因此，针对猪场的微孢子虫防控，首先建议在仔猪进栏前要做好圈舍消毒，实行全进全出制度，并定期检测；其次在饲养过程中要注意猪粪便的处理，保持圈舍卫生，猪粪便必须经过堆肥发酵或消毒处理后才能作为农家肥使用或排入污水中。

4 结论

云南猪场已普遍存在毕氏微孢子虫感染，且均属于具有人兽共患可能性的基因型。因此，要重点加强猪场微孢子虫的防控工作，养殖过程中产生的粪便等养殖污染物必须经过堆肥发酵或消毒处理后才能作为农家肥使用或排入污水中。

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（責任编辑 兰宗宝）