不同培养基凝固剂对水体沉积物中可培养细菌多样性的影响

符运会　屈建航　张璐洁　马文文　 卢斌斌　李海峰

摘要：【目的】研究琼脂和结冷胶两种培养基凝固剂对水体沉积物中可培养细菌多样性的影响，为挖掘环境微生物资源提供科学依据。【方法】以LB为基础培养基，分别以琼脂和结冷胶为凝固剂，利用纯培养法对江苏省太湖水体沉积物中的细菌进行分离培养，结合16S rRNA序列分析法对分离细菌进行多样性分析。【结果】以琼脂和结冷胶为凝固剂，分离获得的细菌总量分别为2.4×105和2.1×105 CFU/g沉积物；16S rRNA序列分析剔除重复菌株后，对应得到20和21株细菌，分别隶属于11和17个细菌属，均归属于厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）三大类群。两种不同凝固剂培养基分离获得的细菌属组成差异明显，在LB琼脂培养基分离获得的20株细菌属为芽孢杆菌属（Bacillus，9株）、动性杆菌属（Planomicrobium，2株）、房间芽孢杆菌属（Domibacillus，1株）、类芽孢八叠球菌属（Paenisporosarcina，1株）、土壤芽孢杆菌属（Solibacillus，1株）、红球菌属（Rhodococcus，1株）、棒状杆菌属（Corynebacterium，1株）、微杆菌属（Microbacterium，1株）、無色杆菌属（Leucobacter，1株）、柠檬球菌属（Citricoccus，1株）和不动杆菌属（Acinetobacter，1株）；在LB结冷胶培养基上分离获得的21株细菌属为芽孢杆菌属（4株）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus，2株）、微小杆菌属（Exiguobacterium，1株）、鸟氨酸芽孢杆菌属（Ornithinibacillus，1株）、葡萄球菌属（Staphylococcus，1株）、虚构芽孢杆菌属（Fictibacillus，1株）、红球菌属（1株）、迪茨氏菌属（Dietzia，1株）、微杆菌属（1株）、考克氏菌属（Kocuria，1株）、四球菌属（Tessaracoccus，1株）、短杆菌属（Brevibacterium，1株）、两面神菌属（Janibacter，1株）、肠杆菌属（Enterobacter，1株）、依格纳季氏菌属（Ignatzschineria，1株）、副球菌属（Paracoccus，1株）和普罗维登斯菌属（Providencia，1株）。【结论】结冷胶作为凝固剂在一定程度上提高了可培养细菌的种类数，结冷胶和琼脂两种凝固剂联合使用可获得更多的细菌种类。

关键词： 凝固剂；结冷胶；琼脂；培养基；可培养细菌；沉积物

中图分类号： S154.381； Q93 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）09-1787-07

0 引言

【研究意义】湖泊是重要的环境生态资源，其水域表层沉积物是物质转化和循环的重要场所，而微生物代谢活动是物质转化和循环的重要推动力（Sauvain et al.， 2014）。水体沉积物中蕴含丰富的细菌群落，其多样性与生态环境息息相关，互为影响（唐婧等，2015）。因此，开展水体沉积物中细菌群落多样性研究，对了解湖泊生态及微生物资源开发具有重要意义。传统的微生物多样性研究离不开微生物的分离和培养，但有研究表明，传统纯培养技术获得的微生物数量只占环境微生物总量的0.1%～1.0%（Amann et al.， 1995），如何提高微生物可培养性，分离获得更多菌种资源，仍是研究的重点和难点。【前人研究进展】已有报道可通过不依赖于培养的分子生态学方法研究湖泊沉积物微生物多样性。如王福芳（2013）利用PCR-DGGE技术和构建16S rRNA基因克隆文库的方法，分析了太湖沉积物中的细菌群落结构，共鉴定出48个不同的基因型；杨江科和程占冰（2016）采用16S rRNA基因克隆文库及PCR-RFLP分析方法对武汉东湖沉积物中的细菌群落进行研究，发现细菌群体包含13个门和2个未知类群；薛银刚等（2018）通过高通量测序方法对太湖冬季表层沉积物中细菌群落结构进行分析，发现9个样品中的细菌主要隶属于25门51纲96属。在微生物分离、培养方面，近年来有报道可通过降低营养浓度（Hashimoto et al.， 2009）、多种培养方法组合（Sipkema et al.， 2011）和改变培养基配方（张瑞杰等，2016）等手段提高微生物的可培养性。传统的微生物分离培养多采用琼脂作为凝固剂。已有研究表明，结冷胶作为凝固剂时分离得到微生物的数量和种类与以琼脂为凝固剂差别较明显（Davis et al.， 2005；Tamaki et al.， 2009），在结冷胶培养基上能分离得到更多的微生物种类（Suzuki et al.， 1999）。【本研究切入点】目前，在水体沉积物的微生物分离培养中以结冷胶作为培养基凝固剂的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以江苏省太湖表层沉积物为材料，利用纯培养方法结合16S rRNA序列分析，比较不同培养基凝固剂对水体沉积物中可培养细菌多样性的影响，为挖掘环境微生物资源提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供式样品：利用抓土漏斗法采集太湖表层沉积物样品，4 ℃运回实验室。主要试剂：Csp6（Thermo）、Hinf I及PCR试剂（Takara）、结冷胶（索莱宝生物科技有限公司）、琼脂（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。主要仪器设备：C1000 Touch PCR仪和Bio-Rad Gel Doc XR凝胶成像仪（Bio-Rad）。

培养基：LB琼脂培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂15 g/L、pH 7.0～7.2，1×105 Pa灭菌20 min）、LB结冷胶培养基[LB琼脂培养基中以结冷胶替换琼脂，添加量8 g/L（Janssen et al.， 2002）]。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 细菌分离纯化 称取10 g沉积物样品置于含有玻璃珠的90 mL无菌水中，28 ℃振荡1 h后，静置30 min，取上清液，10倍梯度稀释至10-9，分别涂布于LB琼脂和结冷胶培养基上，每梯度3组平行。28 ℃培养3 d后，观察并记录单菌落数，细菌菌落计数方法参考陈泽斌等（2014）的方法，挑取形态不同的单菌落进行分离纯化，保存于斜面培养基和甘油管中。

1. 2. 2 16S rRNA序列PCR扩增 碱裂解法（萨姆布鲁克和拉塞尔，2002）制备细菌DNA模板，采用16S rRNA通用引物27f和1492r（Moreno et al.， 2002）进行PCR扩增，扩增体系和条件参照萨姆布鲁克和拉塞尔（2002）的方法进行，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1. 2. 3 16S rRNA序列分析 将不同菌株的16S rRNA序列PCR扩增产物（约1500 bp）送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，所得序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析后，利用MEGA 7.0以邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，发育树用Bootstrap法（1000次重复）检验可信度。

2 结果与分析

2. 1 细菌计数及分离结果

分离结果表明，LB琼脂培养基和LB结冷胶培养基上的菌量分别为2.4×105和2.1×105 CFU/g沉积物，前者分离到的可培养菌量约为后者的1.1倍。结合16S rRNA序列分析剔除重復菌株后，两种培养基分别获得20和21株不同属的细菌。将16S rRNA序列提交到GenBank数据库，LB琼脂培养基中细菌的登录号为MG025780～MG025801（图1），LB结冷胶培养基中细菌的登录号为MG04976～MG049786（图2）。

2. 2 LB琼脂培养基分离细菌的系统发育分析结果

LB琼脂培养基分离获得20株细菌的16S rRNA序列系统发育分析结果（图1）表明，20株细菌归属于厚壁菌门（14株）、放线菌门（5株）和变形菌门（1株）三大类群，分别占分离菌株总数的70.0%、25.0%和5.0%。14株厚壁菌门细菌中，有9株与芽孢杆菌属（Bacillus）关系密切，为厚壁菌门中的最优势属，其次为动性杆菌属（Planomicrobium，2株）、房间芽孢杆菌属（Domibacillus，1株）、类芽孢八叠球菌属（Paenisporosarcina，1株）和土壤芽孢杆菌属（Solibacillus，1株）；放线菌门细菌主要与红球菌属（Rhodococcus，1株）、棒状杆菌属（Corynebacterium，1株）、微杆菌属（Microbacterium，1株）、无色杆菌属（Leucobacter，1株）和柠檬球菌属（Citricoccus，1株）密切相关；变形菌门分离到1株与不动杆菌属（Acinetobacter）关系密切的细菌。

2. 3 LB结冷胶培养基分离细菌的系统发育分析结果

LB结冷胶培养基分离获得21株细菌的16S rRNA序列系统发育分析结果（图2）表明，21株细菌归属于厚壁菌门（10株）、放线菌门（7株）和变形菌门（4株），分别占分离菌株总数的47.6%、33.3%和19.1%。10株厚壁菌门细菌中，有4株与芽孢杆菌属关系密切，为厚壁菌门中的优势属，其次还检测到赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus，2株）、微小杆菌属（Exiguobacterium，1株）、鸟氨酸芽孢杆菌属（Ornithinibacillus，1株）、葡萄球菌属（Staphylococcus，1株）和虚构芽孢杆菌属（Fictibacillus，1株）；放线菌门细菌主要为红球菌属（1株）、迪茨氏菌属（Dietzia，1株）、微杆菌属（1株）、考克氏菌属（Kocuria，1株）、四球菌属（Tessaracoccus，1株）、短杆菌属（Brevibacterium，1株）和两面神菌属（Janibacter，1株）；归于变形菌门的菌株与肠杆菌属（Enterobacter，1株）、依格纳季氏菌属（Ignatzschineria，1株）、副球菌属（Paracoccus，1株）和普罗维登斯菌属（Providencia，1株）关系密切。

2. 4 两种凝固剂分离结果比较

LB琼脂培养基和LB结冷胶培养基分离得到的20和21株细菌在门分类水平上均归属于厚壁菌门、放线菌门和变形菌门三大类群。在属分类水平上（图3），芽孢杆菌属在两种培养基中均为优势属，红球菌属和微杆菌属在两种培养基中也均有分离；但动性杆菌属、房间芽孢杆菌属、类芽孢八叠球菌属、土壤芽孢杆菌属、棒状杆菌属、无色杆菌、柠檬球菌属和不动杆菌属8个属仅从LB琼脂培养基中分离得到（图3-A）；而微小杆菌属、鸟氨酸芽孢杆菌属、葡萄球菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、虚构芽孢杆菌属、考克氏菌属、四球菌属、迪茨氏菌属、两面神菌属、短杆菌属、肠杆菌属、依格纳季氏菌属、副球菌属和普罗维登斯菌属14个属仅从LB结冷胶培养基中分离得到（图3-B），在LB结冷胶培养基上分离到的菌属数量约为琼脂培养基的1.5倍。可见，利用两种凝固剂培养基分离得到的细菌种类差异明显。

3 讨论

由于微生物生存环境的复杂性，传统的培养方法并不能满足微生物生长的需要，已有报道通过延长培养时间（Janssen et al.， 2002）、稀释培养（Cho and Giovannoni， 2004）、添加原始营养因子（李晓丹等，2017）等方法可提高可培养微生物种群数量和种类；模拟自然环境（Bollmann et al.， 2010）和高通量培养（Ringeisen et al.， 2015）等技术也能成功获得部分不可培养或极难培养的微生物。凝固剂作为培养基的重要影响因素，在微生物资源开发方面值得重视。琼脂作为微生物培养基凝固剂一直被使用，但近年来有研究发现结冷胶代替琼脂可提高微生物的可培养数量和种类，增加开发新菌种的几率。Tamaki等（2009）在研究富营养湖泊沉积物细菌多样性时利用琼脂和结冷胶两种凝固剂进行比较分析，结果表明，结冷胶作为凝固剂不仅提高了微生物的可培养数量、增大了新菌发现的可能性，还缩小了与分子生态学方法获得结果的差异。蔡莹等（2010）发现结冷胶培养基上分离的细菌数量和多样性高于琼脂培养基。金一荻等（2012）在研究乌梁素海水中可培养细菌的多样性时采用结冷胶作为培养基凝固剂，发现可培养细菌总数多于传统琼脂培养基。Rygaard等（2017）研究发现培养基凝固剂由琼脂更换为结冷胶时，海洋微生物活细胞数量提高了3～40倍，可培养菌量最高达6.6%。本研究比较琼脂和结冷胶两种凝固剂培养基对太湖水体沉积物中细菌可培养性的影响，所得细菌量分别为2.4×105和2.1×105 CFU/g沉积物，前者分离到的可培养细菌量约是后者的1.1倍。二者在分离细菌具体菌属组成上存在较明显差异，仅芽孢杆菌属、红球菌属和微杆菌属细菌在两种凝固剂培养基中共有。在LB琼脂培养基中分离得到房间芽孢杆菌属、动性杆菌属和土壤芽孢杆菌属等8个属；而迪茨氏菌属、依格纳季氏菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和鸟氨酸芽孢杆菌属等14个属在LB结冷胶培养基上特有，在LB结冷胶培养基上分离到的菌属数量约为琼脂培养基的1.5倍。

Zhang等（2018）利用中等浓度（0.9%）的结冷胶作为培养基凝固剂培养酵母菌，结果发现在细胞形态和计数方面与琼脂培养基差别不明显。在本研究中，两种凝固剂在检测水体沉积物可培养细菌多样性的种类和数量上均有差别，推测造成这种差别的原因与二者间的组分差异有关。Rygaard等（2017）研究认为琼脂作为凝固剂可能使培养群落的组成偏向于专门利用琼脂或其释放的半乳糖残基的微生物；而结冷胶是由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸及L-鼠李糖通过糖苷键连接而成的一种主要源自微生物的胞外多糖，可能来自结冷胶的葡萄糖、葡萄糖醛酸和鼠李糖残基，能刺激更广泛的微生物生长。可见，凝固剂作为微生物分离培养过程中培养基的重要组成，使用琼脂外的其他胶凝剂，可为了解环境中可培养微生物的多样性及资源开发提供一定帮助。

4 结论

采用琼脂和结冷胶两种培养基凝固剂，比较不同培养基凝固剂对水体沉积物中可培养细菌多样性的影响，结果表明，两种培养基分别分离得到20和21种细菌，各属于11和17个种属，菌属组成差异明显，其中仅有芽孢杆菌属、红球菌属和微杆菌属在两种培养基中均可分离获得。可见，结冷胶凝固剂一定程度上提高了可培养细菌的种类数，若同时利用结冷胶和琼脂两种凝固剂可获得更多的细菌种类。

参考文献：

蔡莹， 李志江， 田蕴， 郑天凌. 2010. 虾池沉积物细菌多样性分析和若干可培养技术的优化探讨[J]. 厦门大学学报（自然科学版）， 49（5）： 731-737. [Cai Y， Li Z J， Tian Y， Zheng T L. 2010. Bacterial diveisity in aquaculture environment and optimization of culturing technique[J]. Journal of Xiamen University（Natural Science）， 49（5）：731-737.]

陈泽斌， 夏振远， 雷丽萍， 黄鹤平， 张永福， 莫丽玲， 靳松. 2014. 云南烟草内生细菌菌群密度及分布特征[J]. 西南农业学报，27（2）：682-687. [Chen Z B， Xia Z Y， Lei L P，Huang H P，Zhang Y F，Mo L L，Jin S. 2014. Study on population density and distribution characteristics of endophytic bacteria in tobacco in Yunnan[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，27（2）：682-687.]

金一荻， 冯福应， 赵宇龙， 张晓军. 2012. 基于结冷胶培养基的乌梁素海水体中可培养细菌的多样性研究[J]. 内蒙古农业大学学报， 32（2）： 160-165. [Jin Y D， Feng F Y， Zhao Y L， Zhang X J. 2012. Cultivable bacteria diversity of Wuliangsuhai Lake by using gellan gum medium[J]. Journal of Inner Mongolia Agricultural University，32（2）：160-165.]

李晓丹，屈建航，周佳，张璐洁，李海峰，田海龙. 2017. 泥浸汁对太湖沉积物中的好氧可培养细菌多样性的影响[J]. 微生物学通报，44（3）： 554-560. [Li X D， Qu J H， Zhou J， Zhang L J， Li H F， Tian H L. 2017. Effect of sediment extract on the culturable aerobic bacterial diversity in the sediments of Taihu Lake[J]. Microbiology China，44（3）： 554-560.]

薩姆布鲁克 J， 拉塞尔 D W. 2002. 分子克隆实验指南[M]. 第3版. 黄培堂， 译. 北京： 科学出版社： 27. [Sambrook J， Russell D W. 2002. Molecular Cloning： A Laboratory Manual[M]. The 3rd Edition. Translated by Huang P T. Beijing： Science Press：27.]

唐婧， 徐小蓉， 商传禹， 牛晓娟， 张习敏， 乙引. 2015. 南明河城区河段细菌多样性与环境因子的关系[J]. 微生物学报，55（8）：1050-1059. [Tang J， Xu X R， Shang C Y， Niu X J， Zhang X M， Yi Y. 2015. Association of bacterial diversity in city area of Nanming River with environmental factors[J]. Acta Microbiologica Sinica，55（8）：1050-1059.]

王福芳. 2013. 水体表层沉积物中细菌群落结构研究[D]. 郑州： 河南工业大学. [Wang F F. 2013. Study on characteristics of bacterial community structure of the interfacial water-sediment[D]. Zhengzhou：Henan University of Technology.]

薛银刚， 刘菲， 江晓栋，耿金菊， 滕加泉， 谢文理， 张皓， 陈心一. 2018. 太湖不同湖区冬季沉积物细菌群落多样性[J]. 中国环境科学， 38（2）：719-728. [Xue Y G， Liu F， Jiang X D， Geng J J， Teng J Q， Xie W L， Zhang H， Chen X Y. 2018. The diversity of bacterial communities in the sediment of different lake zones of Lake Taihu in winter[J]. China Environmental Science， 38（2）：719-728.]

楊江科，程占冰. 2016. 富营养化城市湖泊武汉东湖沉积物微生物群体结构及空间变化研究[J]. 微生物学报，56（6）： 943-955. [Yang J K， Cheng Z B. 2016. Community composition and spatial variation of bacteria in the sediments of a eutrophic fresh water urban lake， East Lake， Wuhan， China[J]. Acta Microbiologica Sinica， 56（6）： 943-955.]

张瑞杰， 张琼琼， 黄兴如， 郭逍宇. 2016. 基于分离培养方法的香蒲根内生细菌多样性[J]. 湿地科学， 14（2）： 201-210. [Zhang R J， Zhang Q Q， Huang X R， Guo X Y. 2016. Diversity of endophytic bacteria in roots of Typha orientalis estimated by culture method[J]. Wetland Scien-ce， 14（2）： 201-210.]

Amann R I， Ludwig W， Schleifer K H. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews， 59（1）： 143-169.

Bollmann A， Palumbo A V， Lewis K， Epstein S S. 2010. Isolation and physiology of bacteria from contaminated subsurface sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology， 76（22）： 7413-7419.

Cho J C， Giovannoni S J. 2004. Cultivation and growth cha-racteristics of a diverse group of oligotrophic marine Ga-mmaproteobacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology， 70（1）： 432-440.

Davis K E R，Shayne J，Janssen P H. 2005. Effects of growth medium， inoculum size， and incubation time on cultu-rability and isolation of soil bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology， 71（2）： 826-834.

Hashimoto T， Koga M， Masaoka Y. 2009. Advantages of a diluted nutrient broth medium for isolating N2-producing denitrifying bacteria of α-proteobacteria in surface and subsurface upland soils[J]. Soil Science and Plant Nutrition， 55（5）： 647-659.

Janssen P H， Yates P S， Grinton B E， Taylor P M， Sait M. 2002. Improved culturability of soil bacteria and isolation in pure culture of novel members of the divisions Acidobacteria， Actinobacteria， Proteobacteria， and Ve-rrucomicrobia[J]. Applied and Environmental Microbiolo-gy， 68（5）： 2391-2396.

Moreno C， Romero J， Espejo R T. 2002. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology， 148（4）：1233-1239.

Ringeisen B R， Rincon K， Fitzgerald L A， Fulmer P A. Wu P K. 2015. Printing soil： A single-step， high-throughput method to isolate micro-organisms and near-neighbour microbial consortia from a complex environmental sample[J]. Methods in Ecology and Evolution， 6（2）： 209-217.

Rygaard A M， Th?gersen M S， Nielsen K F， Gram L，Bentzontilia M. 2017. Effects of gelling agent and extracellular signaling molecules on the culturability of marine bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology， doi： 10.1128/AEM.00243-17.

Sauvain L， Bueche M， Junier T， Matthieu， Wunderlin T， Milleret R K， Diez E G， Loizeau G L， Waeber M L T， Junier P. 2014. Bacterial communities in trace metal contaminated lake sediments are dominated by endospore-forming bacteria[J]. Aquatic Sciences， 76（1）： 33-46.

Sipkema D， Schippers K， Maalcke W J， Yu Y， Salim S， Blanch H W. 2011. Multiple approaches to enhance the cultivability of bacteria associated with the marine sponge Haliclona（gellius） sp.[J]. Applied and Environmental Microbiology， 77（6）： 2130-2140.

Suzuki S I， Okuda T， Komatsubara S. 1999. Selective isolation and distribution of sporichthya strains in soil[J]. A-pplied and Environmental Microbiology，65（5）：1930-1935.

Tamaki H， Hanada S， Sekiguchi Y， Tanaka Y， Kamagata Y. 2009. Effect of gelling agent on colony formation in so-lid cultivation of microbial community in lake sediment[J]. Environmental Microbiology， 11（7）： 1827-1834.

Zhang L G， Du J H， Yang J. 2018. Low acyl gellan gum as a gelling agent in medium of saccharomyces yeasts[J]. International Journal of Food Engineering， doi： 10.1515/ijfe-2017-0292.

（責任编辑 麻小燕）