糖基化卵白蛋白肽的制备工艺优化及特性与结构分析

刘丽莉，李玉，杨陈柳，梁严予，代晓凝，孟园园，陈珂

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳，471023)

卵白蛋白(ovalbumin，OVA)是蛋清蛋白的主要蛋白组分，其含量占蛋清蛋白总量的54%，是一种优质蛋白质[1]。OVA的分子质量为44.5 kDa，是典型的含磷球形的糖蛋白，其等电点为4.5，由385个氨基酸组成[2]。每1个OVA分子含有1个二硫键和4个巯基，是蛋清蛋白中唯一1个含有游离巯基的蛋白质[3]。

蛋清粉具有便于运输、易于贮藏等优点，然而却因其腥味重、黏度大、溶解性差等缺点严重限制了其在食品加工中的应用。因此，采用适当的方法对蛋清粉进行改性是亟待解决的问题。目前，国内外学者采用各种方法对OVA进行改性以期改善其功能性质[5-8]。目前，对于OVA的改性只研究了单一方法对其性质的影响，而采用协同改性的方法对OVA进行改性却未见报道。

酶法改性条件温和，一般不会造成营养成分的损失，糖基化反应可以提高产品风味及功能性质[9-10]。因此本文采用协同改性——酶法和糖基化相结合的方法对OVA进行改性，对OVA酶解物进行糖基化反应，优化糖基化反应的工艺条件，并对协同改性前后产物的功能和结构性质进行研究，旨在为加工改性OVA在食品产业中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡蛋购买于河南省洛阳市大商新玛特超市。

葡聚糖T6 (5400-6600),上海蓝季科技发展有限公司；甲醛,洛阳昊华化学试剂有限公司；邻苯二甲醛,甘肃双赢化工有限公司；硼砂、十二烷基磺酸钠,天津市德恩化学试剂有限公司；β-巯基乙醇,上海伟进生物科技有限公司；溴酚蓝,天津市光复精细化工研究所；木瓜蛋白酶(酶活1 000 U/g),如吉生物科技有限公司；中性蛋白酶(酶活50 U/mg)，风味蛋白酶(酶活20 000 U/g),上海蓝季生物有限公司；溴化钾(光谱纯),郑州市米莱化工产品有限公司；其余试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

DYCZ-24DN垂直电泳槽、DYY-6C型稳压稳流型电泳仪,上海博通化学科技有限公司；Alpha凝胶成像系统,美国Protein Simple公司；高速冷冻离心机,美国Finnigan公司；真空冷冻干燥机,美国惠普公司；傅里叶变换红外光谱仪,德国Bruck VERTEX70；日本电子扫描电镜IT100,上海百贺仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 OVA肽及其糖基化产物制备

参照课题组以前的方法[11]制备OVA肽并作适当修改，称取一定量OVA溶解于蒸馏水中，配制6%的蛋白溶液，采用m(木瓜蛋白酶)∶m(中性蛋白酶)∶m(风味蛋白酶)=1∶1∶2的复合酶进行酶解，其酶解条件为加酶量7 500 U/g，pH 7.2，酶解温度57.5 ℃，时间7.2 h。酶解结束后灭酶、离心，取上清液冷冻干燥，得到OVA酶解物即OVA肽。

称取一定量的OVA肽，溶于一定量的去离子水中，按一定比例加入葡聚糖T6，充分搅拌溶解。调节溶液pH值，在适当温度下反应一定时间，反应结束后立即置于冰浴冷却至室温。冷冻干燥后得到OVA肽糖基化产物。

1.3.2 接枝度的测定

根据JIANG[12]方法测定糖基化产物接枝度，取200 μL蛋白浓度为4 mg/mL的样品液，加入4 mL OPA试剂，混匀后于35℃水浴锅中反应2 min，然后在340 nm处测吸光值。空白对照为：4 mL OPA试剂和200 μL水。接枝度(DG)按下式计算。

(1)

式中：At为t时刻样品的吸光度；A0为未反应的吸光度。

1.3.3 褐变程度的测定

根据张蓓[13]方法测定褐变程度，取样品液1 mL加入5 mL 0.1% SDS稀释，0.1% SDS作为空白，在420 nm波长处测定其吸光值，即为褐变指数。

1.3.4 OVA肽糖基化反应工艺条件优化

1.3.4.1 单因素试验设计

分别以反应温度(30、40、50、60、70、80 ℃)、pH值(6、7、8、9、10、11)、蛋白与糖的质量比(4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)、蛋白质量浓度(2、4、6、8、10、12 g/100 mL)及反应时间(1、2、3、4、5、6 h)为单因素，考察各因素对接枝度及褐变程度的影响。

1.3.4.2 二次正交旋转组合设计

在单因素试验的基础上，以pH值、蛋白质量浓度、OVA肽∶糖(质量比)、反应时间、反应温度5个因素为自变量，以接枝度(Y)为响应值，设计共36个试验点的五元二次正交旋转组合试验，因素水平见表1。

1.3.5 协同改性前后卵白蛋白功能特性的测定

1.3.5.1 乳化性能的测定

参照AGYARE等[15]的方法并作适当修改，将一定量的样品蛋白溶解在pH 7.4 Tris-HCl缓冲液中，制成蛋白浓度为1 mg/ml的溶液。取20 mL蛋白溶液加入5 mL大豆油，10 000 r/min 均质1 min，分别取均质后0、10 min的最底层乳化液100 μL加入到100 mL 0.1%的SDS溶液中，用紫外分光光度计在500 nm波长处测定其吸光值，空白为0.1% SDS溶液。乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性(ESI)分别由式(2)、式(3)来计算：

表1 五元二次正交旋转组合设计试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in second-ordel rotation combination experimental design

(2)

(3)

式中：A0、A10,乳浊液在0、10 min的吸光值；φ,油相体积分数(油的体积/乳浊液的体积);ρ,蛋白质质量浓度，g/mL;F,稀释倍数。

1.3.5.2 起泡性能的测定

参照JING等[16]的方法测定蛋白质的起泡性，将一定量的蛋白溶于pH 7.4 Tris-HCl缓冲液中，配制成蛋白质量浓度为1 mg/mL的溶液，取50 mL蛋白溶液，记录起始高度H0，10 000 r/min均质2 min后记录高度H1，静置10 min后再次记录高度H2。蛋白溶液起泡性(FAI)和泡沫稳定性(FSI)的计算公式如下：

(4)

(5)

1.3.6 协同改性前后卵白蛋白的结构分析

1.3.6.1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定

以分子质量为6.5～200 kDa标准蛋白为对照，采用SDS-PAGE分析OVA、OVA肽、糖基化OVA肽的分子质量变化，其中分离胶10%，浓缩胶5%。

1.3.6.2 傅里叶转换红外(FT-IR)分析

将冷冻干燥后的待测样品与KBr按1∶100的质量比混合，置于玛瑙研钵中研磨至粉末状，将样品置于样品槽中，在压力10～15 MPa下压片，1 min后将样品取出，放入样品室，采用红外光谱仪在400～4 000 cm-1波长区间对样品进行扫描。

1.3.6.3 扫描电镜(SEM)分析

将待测样品用导电胶带固定于样品台上，采用离子溅射仪进行喷金，抽真空1 h左右，在扫描电子显微镜下观察样品的微观结构。

1.4 数据分析

每个试验重复3次，取其平均值。通过Origin Pro 8.5软件对数据进行统计分析，采用DPS V 7.0专业版进行显著性分析，设计专家Design-Expert. 8.0.5程序，作响应曲面图和等高线图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

单因素试验结果如图1所示。

a-pH值对接枝度和褐变程度的影响;b-底物配比对接枝度和褐变程度的影响;c-蛋白质量浓度对接枝度和褐变程度的影响;d-反应时间对接枝度和褐变程度的影响;e-反应温度对接枝度和褐变程度的影响图1 单因素试验结果Fig.1 Results of single-factor experiments

接枝度表示糖基化反应进行的程度，褐变程度则表示反应混合物的颜色变化，糖基化反应中希望减少有色物质的生成，同时增加初级阶段和中级阶段产生的功能特性较好的无色物质[17]。由图1可知，随着pH值的增大，接枝度增大；当pH值达到8时，接枝度达到最大，此后随着pH值的增大，接枝度逐渐减小，而褐变程度随着pH值的增大，逐渐增大，故选取最佳pH值为8(图1-a)；随着葡聚糖T6添加量的增加，接枝度先升高后下降，当OVA肽与葡聚糖T6的质量比为1∶1时，接枝度最大，且褐变程度较适宜。所以选择底物配比为1∶1(图1-b)；随着蛋白质量浓度的升高，接枝度先上升后下降，褐变程度逐渐增大。因此，OVA肽的质量浓度为8 g/100 mL较为适宜(图1-c)；随着反应的进行，接枝度逐渐上升，当反应4 h时接枝度达到最大，随后开始下降；褐变程度呈现逐渐上升的趋势，因此，反应时间选择4 h(图1-d)；随着糖基化反应温度的上升，接枝度逐渐增加，当温度到达60 ℃时接枝度开始出现下降趋势，褐变程度逐渐增加。所以选取60 ℃为最佳反应温度(图1-e)。

2.2 响应面优化试验结果分析

在单因素试验的基础上，进行五元二次正交旋转组合试验，结果见表2。

表2 五元二次正交旋转组合试验设计方案及结果Table 2 Quadratic orthogonal rotary composite experimental design (in coded level of five variables) and experimental result (n=3)

续表2

试验号X1X2X3X4X5接枝度/% 71-1-11125.7481-1-1-1-123.199-1111-132.5310-111-1133.2311-11-11125.7512-11-1-1-123.1013-1-111127.0414-1-11-1-120.4215-1-1-11-124.2316-1-1-1-1119.6717-2000024.68 182000027.87 190-200021.37 200200027.37 2100-20020.15220020026.81 23000-2026.21 240002030.70 250000-229.08 260000226.50 270000037.10280000036.94290000034.19300000038.14310000032.21320000032.81330000033.81340000038.27350000036.58360000035.40

2.2.1 回归模型方差分析和显著性检验

采用Design-Expert. 8.0.5统计分析软件对试验结果进行多元回归拟合，回归方程的方差分析结果见表3。

表3 试验结果方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model equation

续表3

变异来源平方和自由度均方F值p值显著性X3X58.2118.211.560.230 5不显著X4X53.5213.520.670.426 2不显著X12123.851123.8523.570.000 2极显著X22191.071191.0736.36<0.000 1极显著X32227.451227.4543.28<0.000 1极显著X4264.73164.7312.320.003 2极显著X5280.75180.7515.370.001 4极显著回归1 059.712052.9910.08<0.000 1极显著剩余78.83155.26失拟35.7765.961.250.367 9不显著误差43.0694.78总和1 138.5435

注：p<0.01影响极显著；p<0.05影响显著。

本试验构建的模型在α=0.05显著水平下剔除不显著水平后的回归方程为：

Y=-2 846.281+52.730X2+123.730X3+61.895X4-9.850X1X3-1.134X1X5-7.869X12-2.444X22-42.657X32-5.689X42-0.254X52

2.2.2 构建模型的等高线和响应面分析

各因素交互作用对接枝度的影响如图2所示。

a-pH与OVA肽∶糖(质量比);b-pH与反应温度图2 各因素交互作用对接枝度的影响Fig.2 Response surface and corresponding contour plots showing the effect of interaction of various factors on the grafting degree

由图2-a可知，pH与OVA肽∶糖对接枝度的交互影响呈抛物线形，等高线呈椭球状，说明pH与OVA肽∶糖对接枝度的交互作用对接枝度影响显著。当pH在8.9～9.3，OVA肽∶糖(质量比)为1∶1.45～1∶1.65时，两者的交互作用最明显，此时接枝度达到30%以上。低于此范围时，接枝度随pH与OVA肽∶糖水平的增加而增大；高于此范围时，接枝度随pH与OVA肽∶糖水平的增加而减小。

由图2-b可知，pH与反应温度对接枝度的交互影响呈抛物线形，等高线呈椭球状，说明pH与反应温度对接枝度的交互作用对接枝度影响显著。当pH为8.7～9.5，反应温度为63～67 ℃时，两者的交互作用最明显，此时接枝度达到30%以上。

采用Design-Expert. 8.0.5分析，确定最佳糖基化改性条件为pH 9、蛋白质量浓度8 g/100mL、OVA肽∶糖(质量比)为1∶1.5、反应时间4.5 h、反应温度65 ℃，此时最高接枝度为36.78%，通过验证实验接枝度的平均值为(35.67±0.74)%，与理论预测值误差绝对值为3.02%，表明优化的糖基化条件可信。

2.3 协同改性前后功能特性的变化

由表4可知，OVA肽较OVA乳化活性指数和乳化稳定性分别提高了28.88 m2/g，25.20%。这是因为酶解使得OVA的疏水基团增加，结合油滴的能力增强[18]，亲水基团伸展到水相中，提高了OVA的乳化性和乳化稳定性。协同改性后的OVA的乳化活性指数比OVA提高了51.20 m2/g，乳化稳定性提高了38.14%。原因可能是糖基化反应后使蛋白形成多聚物后，产生了许多支链基团，从而使蛋白质的空间位阻增大[19]，同时糖基化反应后生成的蛋白聚合物的黏弹性比未处理的OVA高。

表4 协同改性前后OVA的功能性质Table 4 The functional properties of OVA before and after the synergistic modification

注：结果以平均值±标准差表示，同列字母不同表示差异显著(p<0.05)。

OVA肽和协同改性OVA的起泡性和泡沫稳定性较未改性OVA都有明显提高。原因可能是蛋白质的溶解度与起泡性能呈正相关，酶解和协同改性均使OVA的溶解度得到提高，从而使得协同改性后OVA的起泡性提高。同时，OVA肽与葡聚糖进行糖基化反应后，引入了多羟基，使得分子间的作用力增强，蛋白质膜的厚度和硬度增加[20]，从而使协同改性OVA的泡沫稳定性增强。

2.4 协同改性前后结构性质的分析

2.4.1 SDS-PAGE分析

OVA、OVA肽及糖基化OVA肽的SDS-PAGE电泳图如图3所示。

Marker-标准蛋白；1-OVA；2-OVA肽；3、4-糖基化OVA肽平行样图3 改性前后OVA SDS-PAGE电泳图Fig.3 SDS-PAGE of OVA before and after the modification

由图3可知，1号泳道大部分条带出现在45.0 kDa处，即为OVA。在66.4～97.2 kDa处出现了一条蛋白条带，可能是未除去的卵转铁蛋白[21]。2号泳道的电泳条带相对于OVA来说，出现明显下移，且条带分散，说明蛋白分子在酶解作用下被降解为小分子肽，其分子质量分布在14.3～29 kDa。3、4号泳道均为糖基化OVA肽，其条带相对于OVA肽明显上移至45.0～97.2 kDa，这表明葡聚糖连接到OVA肽上使其分子质量增大[22]。

2.4.2 傅里叶红外光谱分析

OVA、OVA肽及糖基化OVA肽的红外光图谱如图4所示。

图4 红外光谱图分析Fig.4 Analysis of fourier transform infrared spectrometer

2.4.3 扫描电镜分析

a-OVA;b-OVA肽;c-糖基化OVA肽图5 改性前后OVA的SEM图Fig.5 Scanning electron micrographs of before and after Ovalbumin

分别将OVA、OVA肽及糖基化OVA肽置于扫描电镜下，放大同样倍数，结果如图5所示。由图中可以看出OVA为典型的球蛋白[25]，表面光滑，成颗粒状，排列紧密，表面有明显的孔洞和不规则的凹陷。酶解之后，表面不规则的凹陷消失，相对于OVA颗粒变小，分子间的聚集程度加深，成簇状，排列更紧密。经过酶解和糖基化处理后，体系的微观结构发生明显变化，球状完全变成片状结构，排列紧密，表面有不规则的凸起或凹陷，分子间的交联程度较好。这说明酶解和糖基化协同改性使其微观结构发生明显变化。

3 结论

通过响应面法对OVA肽糖基化改性的工艺条件进行优化，确定最佳工艺条件为pH 9、蛋白质量浓度8 g/100mL、OVA肽∶糖(质量比)为1∶1.5、反应时间4.5 h、反应温度65 ℃，在此条件下，糖基化接枝度为(35.67±0.74)%。对改性前后OVA的乳化性、起泡性进行了分析。结果表明，协同改性较单独酶解明显改善了OVA的功能特性，为改善OVA的功能性质提供了一种有效的新方法。

对协同改性前后OVA进行了SDS-PAGE、红外、扫描电镜分析，结果表明协同改性使其分子质量发生明显变化，由原来的44.3 kDa变为45.0～97.2 kDa；蛋白的二级结构被破坏，葡聚糖连接到OVA肽上，部分吸收峰变强；协同改性使其微观结构发生明显变化，由原来球状变成片状结构，排列更加紧密。