豌豆肽对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影响

张敏佳，刘文颖，贾福怀，刘伟，周雅琳，熊菲菲，袁媛，蔡木易*，许雅君, 4

1(北京大学 公共卫生学院，营养与食品卫生学系，北京，100191) 2(中国食品发酵工业研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京，100015) 3(宁波御坊堂生物科技有限公司，浙江 宁波，315012) 4(食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京，100191)

生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，生物学意义主要体现在其优于氨基酸的吸收机制和生理功能。已有研究显示，不同种类的生物活性肽具有抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抗氧化和清除自由基等生物学作用[1]。目前，人们已从动物、植物和微生物中制备了许多不同种类的生物活性肽[2]，其中植物蛋白来源主要是谷物，如大豆、小麦、大米、燕麦和黑麦等[3]。植物蛋白由于其来源广泛，价格低廉，以其为原料利用适当方法制备的低聚肽生物效价可接近动物蛋白，因此对植物源生物活性肽的研究开发日益受到人们的重视[4]。

豌豆，别称寒豆、麦豆、雪豆、毕豆、国豆等，种植广泛，是我国重要的农作物之一。豌豆的主要成分是淀粉和蛋白质，豌豆蛋白是一种优质蛋白，氨基酸比例均衡，基本达到FAO/WHO推荐模式值[5]。目前，我国对于豌豆蛋白尚未能进行充分开发利用，相关研究较少，有限的研究发现豌豆蛋白水解物具有抗氧化活性[6]，但对于豌豆肽的其他功能鲜有探索。本实验以CTX诱导的免疫抑制小鼠为模型，探究豌豆肽对免疫抑制小鼠免疫功能的影响，为豌豆肽的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用豌豆肽干粉以豌豆蛋白为原料，经酶解、精制、喷雾干燥、包装后所得。

酪蛋白(Sigma C5890)，环磷酰胺(Sigma C0768)，北京宝瑞杰科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平(奥豪斯SPN3001F)，电子天平(赛多利斯BS2000S)，NIKON TE2000-S 倒置荧光显微镜，全自动血细胞分析仪(日本光电工业株式会社，MEK-6318K)，流式细胞仪(美国BD FACS Calibur)，罗氏全自动生化仪501，超微量分光光度计(德国Nano Photometer P-Class)。

1.3 实验动物

健康SPF级雌性ICR小鼠，6～8周龄，体重(27±2) g，由北京大学医学部实验动物中心提供[SCXK(京)2016—0010]。动物饲养在屏障环境，温度控制在(22±2)℃，相对湿度50%～60%，昼夜照明时间为12 h∶12 h。实验期间动物自由饮水和进食。

1.4 实验动物分组与处理

实验动物适应性喂养3 d后，称量初始体重，按体重随机分为5组，每组12只，分别为对照组，CTX模型组及豌豆肽低、中、高剂量组。实验第1～3天，除对照组外，其余各组每天腹腔注射80 mg/(kg·bw)CTX，建立免疫抑制小鼠模型，对照组每天注射等量生理盐水。第4天起，每天给予对照组和CTX模型组1.6 g/(kg·bw)酪蛋白灌胃，豌豆肽低、中、高剂量组分别给予0.4、0.8、1.6 g/(kg·bw)豌豆肽，灌胃体积为0.1 ml/(10 g·bw)，连续灌胃15 d后动物隔夜禁食，第二天晨起进行指标检测。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 体重和免疫脏器指数

分别于分组前及实验第15天称量动物初始体重和终末体重，并于动物处死前再次称量体重，用于免疫脏器指数计算。摘眼球取血后，断颈处死小鼠，分离脾脏和胸腺，并用电子天平称重，分别计算脾脏指数和胸腺指数，脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)。

1.5.2 免疫脏器形态学观察

将称重后的脾脏和胸腺固定于4%甲醛溶液中，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining ，HE 染色) ，显微镜下观察脾脏组织和胸腺组织的形态学变化。

1.5.3 外周血白细胞计数

动物摘眼球取血，取适量全血于EDTA抗凝管中，立即颠倒混匀，使用全自动血细胞分析仪计数白细胞。

1.5.4 骨髓有核细胞计数和DNA含量

每组取6只小鼠股骨进行骨髓有核细胞计数[7]：去除股骨附着的肌肉及结缔组织，用1 mL Hank′s液将骨髓液冲洗至已加入EDTA的离心管内。吸取0.38 mL 0.1 mol/L HCl溶液于另一离心管，加入混匀后的骨髓液20 μL混匀，静置2～3 min待红细胞溶解。取20 μL冲入细胞计数板进行计数。

另每组取6只小鼠股骨进行骨髓DNA含量检测[8]：吸取10 mL 5 mmol/L的CaCl2溶液，将全部骨髓冲入离心管中，在4 ℃条件下放置30 min，2 500 r/min离心15 min，弃掉上清，向沉淀物中加入0.2 mol /L的HClO4溶液5 mL，充分混匀，90 ℃水浴15 min，冷却至室温后，3 500 r/min离心15 min，取上清液，用超微量分光光度计在260 nm处测定吸光度A260值，计算骨髓DNA含量。

1.5.5 外周血免疫球蛋白含量测定

动物摘眼球取血，离心制血清，取200 μL血清使用全自动生化仪检测免疫球蛋白IgG、IgM含量。

1.5.6 外周血、脾脏T 淋巴细胞亚群检测

收集小鼠脾脏制备单细胞悬浮液，350×g离心5 min，弃上清，加入2 mL 1×裂解液将细胞沉淀重悬。冰上孵育5 min后加入2 mL PBS，350×g离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS。计数细胞，调整浓度为1×106/100 μL。取100 μL细胞悬液于流式管，加入3种荧光染料缀合的抗体，避光孵育30 min，每5 min混匀1次。加入1 mL PBS清洗细胞，350×g离心5 min，弃上清，加300 μL 2%多聚甲醛溶液重悬细胞，用流式细胞仪检测CD3+、CD4+和CD8+细胞亚群百分比。

1.5.7 血清中细胞因子水平测定

取50 μL血清，采用流式微球阵列(cytometric bead array，CBA)液相多重蛋白定量技术检测细胞因子水平。使用Biolegend Multi-Analyte Flow Assay Kit并按其说明书制备标准品及待测样品，用流式细胞仪进行检测。

2 结果

2.1 豌豆肽对免疫抑制小鼠体重和免疫脏器指数的影响

如表1所示，各组小鼠初始体重和终末体重无统计学差异(p>0.05)，各组胸腺指数和脾脏指数也无统计学差异(p>0.05)。

表1 豌豆肽对免疫抑制小鼠体重和免疫脏器指数的影响Table 1 Effects of pea peptide on body weight and immune organ index of immunosuppression mice induced by CTX

2.2 豌豆肽对免疫抑制小鼠脾脏和胸腺组织结构的影响

显微镜下脾脏HE染色切片如图1所示，对照组脾脏组织结构清晰，白髓、红髓、边缘区界限明显，脾小结发育良好。CTX模型组白髓与红髓界限模糊，脾小结不完整。与模型组相比，豌豆肽低、中、高剂量组脾小结结构逐渐恢复，脾脏结构逐渐清晰。

A-对照组；B-模型组；C-低剂量组；D-中剂量组；E-高剂量组图1 豌豆肽对免疫抑制小鼠脾脏组织形态学变化的影响(×100)Fig.1 Effects of pea peptide on morphologic variations of spleen of immunosuppression mice induced by CTX(×100)

胸腺HE染色切片如图2所示，对照组胸腺皮质、髓质结构清晰，皮质染色较深且面积大于髓质，淋巴细胞排列紧密。CTX模型组胸腺皮质、髓质分界不清，皮质面积减小，髓质面积增大，皮质区淋巴细胞减少。与模型组相比，豌豆肽低、中、高剂量组皮质面积呈剂量依耐性增加，皮、髓交界清晰。

A-对照组；B-模型组；C-低剂量组；D-中剂量组；E-高剂量组图2 豌豆肽对免疫抑制小鼠胸腺组织形态学变化的影响(×40)Fig.2 Effects of pea peptide on morphologic variations of thymus of immunosuppression mice induced by CTX(×40)

2.3 豌豆肽对免疫抑制小鼠外周血白细胞计数的影响

如表2所示，与对照组相比，CTX模型组小鼠外周血白细胞计数显著下降(p<0.05)；豌豆肽干预后白细胞计数有不同程度的恢复，低剂量组与模型组相比有所增高，但差异无统计学意义(p>0.05)，与对照组相比仍明显偏低(p<0.05)，而豌豆肽中、高剂量组外周血白细胞计数比模型组显著增高(p<0.05)，且恢复到了对照组的水平。

表2 豌豆肽对免疫抑制小鼠外周血白细胞计数的影响Table 2 Effect of pea peptide on white blood cell count of immunosuppression mice induced by CTX

注：与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组相比，#p<0.05，##p<0.01，下表同。

2.4 骨髓有核细胞计数和DNA含量

如表3所示，与对照组相比，CTX模型组骨髓有核细胞浓度和骨髓DNA含量均显著下降(p<0.01)。与模型组相比，豌豆肽低、中、高剂量组骨髓有核细胞浓度有不同程度的升高，低剂量组与模型组相比差异不显著(p>0.05)，中、高剂量组与模型组相比差异有统计学意义(p<0.01，p<0.05)；豌豆肽低、中、高剂量组骨髓DNA含量与模型组相比均有显著升高(p<0.05)。

表3 豌豆肽对免疫抑制小鼠骨髓有核细胞浓度和DNA含量的影响Table 3 Effect of pea peptide on nucleated cell counts and DNA density in bone marrow of immunosuppression mice induced by CTX

2.5 外周血免疫球蛋白含量测定

如表4所示，与对照组相比，CTX模型组外周血免疫球蛋白IgG、IgM含量显著降低(p<0.01)。与模型组相比，豌豆肽高剂量组IgG、IgM含量显著升高(p<0.01，p<0.05)。

表4 豌豆肽对免疫抑制小鼠外周血免疫球蛋白IgG、IgM含量的影响Table 4 Effect of pea peptide on concentration of immunoglobulin IgG and IgM of immunosuppression mice induced by CTX

2.6 脾脏T 淋巴细胞亚群检测

如表5所示，与对照组相比，CTX模型组CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞百分比均显著降低(p<0.01)。与模型组相比，豌豆肽低剂量组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比有所改善，但差异不显著(p>0.05)；豌豆肽中剂量组CD3+、CD4+淋巴细胞百分比有不同程度的增高，差异有统计学意义(p<0.01，p<0.05)，CD8+T淋巴细胞百分比有所改善，但差异不显著(p>0.05)；豌豆肽高剂量组CD3+淋巴细胞百分比显著增高(p<0.05)，CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比有所改善，但差异不显著(p>0.05)。

2.7 血清中细胞因子水平测定

如表6所示，与对照组相比，CTX模型组小鼠外周血中IFN-γ浓度显著降低(p<0.05)。与模型组相比，豌豆肽中、高剂量组小鼠外周血中IFN-γ浓度显著升高(p<0.05)，与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05)。另外，豌豆肽低剂量组小鼠外周血中IL-9、IL-17A浓度与模型组相比显著(p<0.05)，与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05)。其他各细胞因子(TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6)浓度在各组之间差异无统计学意义。

表5 豌豆肽对免疫抑制小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响Table 5 Effect of pea peptide on T-lymphocyte subsets of spleen of immunosuppression mice induced by CTX

表6 豌豆肽对免疫抑制小鼠外周血细胞因子水平的影响Table 6 Effect of pea peptide on T-lymphocyte subsets of spleen of immunosuppression mice induced by CTX

3 讨论

植物蛋白占世界蛋白供应总量的70%以上[4]， 因其营养丰富，价格低廉而日益受到人们的重视。我国幅员辽阔，植物资源丰富，许多重要的农作物如大豆、小麦、玉米等均被开发出多种蛋白产品及其生物活性肽产品[3]。豌豆也是我国重要的农作物之一，但目前对于豌豆蛋白尚未能进行充分开发利用，其生物活性肽产品的功能学研究更少。实验中所用豌豆肽含有丰富氨基酸，其中谷氨酸和谷氨酰胺含量最高，已有研究[9-12]显示谷氨酰胺具有重要的免疫调节功能，因此，本实验采用目前制备动物免疫抑制模型中应用广泛的CTX[13]，建立免疫抑制小鼠模型。同时，给予不同剂量豌豆肽干预15 d，探究豌豆肽的免疫调节功能。

实验结果显示，各组小鼠初始体重和终末体重无统计学差异(p>0.05)，提示环磷酰胺及环磷酰胺与豌豆肽对小鼠的生长发育无明显影响。免疫器官指数是衡量机体免疫功能的初步指标，本实验结果显示，各组胸腺指数和脾脏指数无统计学差异(p>0.05)，可能是由于影响胸腺和脾脏指数的因素较多，准确性难以保证，并且已有文献指出免疫器官质量不能单独作为评价免疫毒性的指标[14]，相似结果也在多项研究中出现[7, 15-16]。与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏和胸腺镜下形态学结构紊乱，外周血白细胞计数、CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比、免疫球蛋白IgG和IgM含量、骨髓有核细胞浓度和DNA含量均显著低于对照组(p<0.01)，细胞因子IFN-γ浓度明显低于对照组(p<0.05)，提示免疫抑制模型建立成功。

免疫器官是机体执行免疫功能的重要部分，是免疫细胞产生、分化、成熟和增值的场所，脾脏是机体最大的免疫器官，参与调解细胞和体液免疫，而胸腺是机体的主要中枢免疫器官，是T细胞生长、分化和成熟的场所，脾脏和胸腺在质量和形态结构上的改变可在一定程度上反应机体免疫功能的变化[17]。本实验结果显示，各组小鼠脾脏、胸腺指数与对照组相比无明显变化，但CTX模型组小鼠脾脏、胸腺组织结构被破坏，而豌豆肽组小鼠脾脏、胸腺结构有所改善，且随剂量升高而更接近对照组，提示豌豆肽对两大免疫器官的组织结构具有保护作用。

白细胞是机体防御系统的重要组成部分，骨髓是人体的造血组织，也是重要的免疫组织，白细胞计数显著降低和骨髓的抑制状态反映机体免疫功能下降。实验结果显示，CTX模型组小鼠外周血白细胞计数、骨髓有核细胞计数和DNA含量显著降低，豌豆肽可增加免疫抑制小鼠的白细胞计数、骨髓有核细胞数量以及骨髓DNA含量，可改善免疫抑制小鼠的免疫功能和骨髓抑制状态。

免疫球蛋白是机体在抗感染方面的重要屏障，IgG、IgM是活化B淋巴细胞产生的主要免疫球蛋白，可反映机体的体液免疫功能[18]。实验结果显示，CTX模型组小鼠外周血免疫球蛋白IgG和IgM含量显著降低，豌豆肽可增加免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgG、IgM含量，表明豌豆肽对免疫抑制小鼠的体液免疫具有改善作用。

T淋巴细胞是一类在胸腺中成熟随后迁移至外周淋巴组织的淋巴细胞，在细胞免疫中起核心作用。细胞膜表面的CD3+为成熟T细胞表面标志，反映总T淋巴细胞水平，根据CD4+和CD8+分子表达情况，可将成熟的T细胞分为CD4+或CD8+细胞，CD4+细胞即T辅助细胞(Th细胞)，CD8+细胞即细胞毒性T细胞。T淋巴细胞亚群的平衡是反映机体免疫稳态的重要指标[19]。实验结果显示，CTX模型组CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞百分比显著降低，显示免疫低下状态。与模型组相比，豌豆肽中剂量组CD3+、CD4+淋巴细胞百分比有不同程度的增高，差异有统计学意义，豌豆肽高剂量组CD3+淋巴细胞百分比显著增高，且各豌豆肽剂量组CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞百分比均比模型组升高，表明豌豆肽能调整免疫低下小鼠T淋巴细胞亚群的异常分布，对CTX致免疫低下小鼠的细胞免疫具有一定的改善作用。

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，在免疫应答中占据着重要地位。CD4+T淋巴细胞存在许多亚群，包括Th1、Th2、Th17、Treg、Th9等[20]。Th1细胞主要通过分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等介导细胞免疫应答；Th2细胞主要通过产生IL-4、IL-6等细胞因子辅助体液免疫应答；Th17可通过分泌IL-17A、IL-17F等因子抵御胞外细菌和真菌感染；Th9作为一种新发现的CD4+T细胞亚群，其分泌的主要细胞因子IL-9参与寄生虫感染、自身免疫性疾病、肿瘤免疫等过程[20-22]。本研究显示，豌豆肽将免疫抑制小鼠外周血细胞因子IFN-、IL-9、IL-17A水平改善至正常，提示豌豆肽可能通过调节IFN-γ、IL-9、IL-17A等细胞因子的分泌进而影响其介导的免疫反应。

实验结果显示，豌豆肽对于不同免疫的调节作用最佳有效剂量不同，对于大多数免疫指标来说，在本研究剂量范围内，随着干预剂量的增加，豌豆肽的免疫调节效果越显著。综上所述，豌豆肽能够通过改善免疫器官发育、骨髓抑制状态、免疫球蛋白含量、T淋巴细胞亚群百分比和细胞因子水平改善CTX致免疫抑制小鼠的免疫功能。本研究为豌豆肽的进一步开发利用提供了理论依据。