菜豆子叶节诱导成苗技术初步研究

陈 高，代祥德，邵景杰，任三国，陈禅友

（江汉大学 生命科学学院；湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北 武汉 430056）

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）属于豆科菜豆属草本植物，又称四季豆、芸豆，菜豆可以食用籽粒或食用豆荚，营养价值丰富，富含大量的蛋白质、氨基酸及多种矿质元素，是世界上许多地区的主要植物蛋白来源之一。采用传统的方法栽培菜豆时其产量会受到光周期、气候、病虫害等外部因素的影响［1］，而植物组织培养技术可以不受外界环境的限制，并在较短的时间内繁殖出较大数量的再生植株［2-3］。另一方面，通过基因工程技术可将外源基因导入菜豆细胞，培养出抗病、抗虫的优良菜豆种质资源，而建立完善的菜豆离体再生体系则是进行菜豆转基因的必要环节之一［4］。

在豆科植物组织培养中，最早是用豌豆的茎段诱导出愈伤组织并得到了再生植株［5］，随后豇豆、大豆、蚕豆及菜豆等豆科植物也被作为离体再生培养材料进行了研究［6-9］。虽然组织培养的快速繁殖技术已经在农业上广泛应用，但豆科植物在组织培养中能再生植株的种类仍然不多，存在再生困难、存活率低等问题，而且种子越大的豆科植物越难再生，同一种类而不同基因型的豆科植物的培养条件也相差较大［10］。因而国内外关于菜豆组织培养技术的研究一直进展缓慢，且大多处于试验阶段，目前未建立系统的离体再生体系，实现产业化［4，11］。不同激素配比与外植体的选择均是影响菜豆组培效果的重要因素，目前常用的激素配比多为生长素与细胞分裂素的不同组合。而菜豆子叶节具有腋芽的特殊结构，且生长迅速、出芽快，是菜豆离体再生的良好材料来源。因而本文以菜豆子叶节为外植体，研究了不同生长素即吲哚丁酸（IBA）和萘乙酸（NAA）以及细胞分裂素6-苄基腺嘌呤（6-BA）和激动素（KT）对菜豆子叶节诱导不定芽和根的影响，并对菜豆组培生根苗进行炼苗和移植，获得完整植株，为进一步建立菜豆离体再生体系，进行菜豆组织快繁及菜豆转基因技术提供实验基础与数据支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

菜豆“Bean white rice”种子由江汉大学湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心收集并提供。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的获取 选取颗粒饱满、大小一致的菜豆种子200粒，清水冲洗30 min后0.1%升汞消毒8 min，无菌水震荡清洗5～8次，去除残留在种子上的升汞。最后用无菌水浸泡种子4 h，使其充分吸胀，倒掉浸泡液，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于MS培养基，每个培养皿3粒种子。消毒和接种过程均在超净工作台上进行。在培养室中培养，培养温度25℃，光照时间12 h/d。

1.2.2 菜豆子叶节不定芽诱导 培养5 d后，选取长势一致的无菌苗，在超净工作台上切除其子叶节上下两端及两片子叶，使节点上端保留约2～5 mm，下端保留约5～10 mm。将子叶节接种于不同激素浓度配比的不定芽诱导培养基中，接种时子叶节下端插入培养基，使用培养瓶培养，每瓶接种3个子叶节，每组激素配比接种3瓶作为平行，在培养室中培养，培养温度25℃，光照时间12 h/d。培养3周，培养过程中注意观察污染情况，并切除长度2 cm以上的不定芽。每隔7 d转一次培养基，记录一次数据，继代培养的培养基与初代培养相同，记录芽长为0～2.0 cm和≥2.0 cm的不定芽个数并计算不定芽分化系数。培养基以MS为基础培养基，添加不同浓度的生长素IBA和NAA以及细胞分裂素6-BA和KT，激素配比如表1所示。

1.2.3 不定芽生根诱导 诱导出不定芽后，切取长势较好、长度在2 cm以上的不定芽接种于不同激素浓度配比的生根培养基中，培养室中培养，培养温度25℃，光照时间12 h/d。每7 d观察记录不定芽生根情况，生根培养基激素配比如表2所示。

1.2.4 炼苗和移栽 培养数周后，选取生长状态较好、生根较多较粗壮的再生苗，移栽到装有灭过菌的培养土（腐殖土与砂3∶1）的培养瓶中，培养1周后将培养瓶的封口膜揭开，每天定时加水，在培养室中培养，培养温度25℃，光照时间12 h/d，观察移栽苗的生长状况。

1.3 数据分析

分化系数=外植体上分化的不定芽数/外植体数；

生根率（%）=生根的外植体数/外植体总数×100%；

数据分析软件采用Microsoft Excel 2013和DPS v7.05处理。

2 结果与分析

2.1 菜豆子叶节不定芽诱导结果

如表3所示，在培养1周后，除A号培养基中的子叶节长出根外，其他子叶节的伤口膨大形成愈伤组织，B～H号培养基的子叶节芽点生长状态不佳。I～P号培养基中的子叶节生长状况良好。培养2周后，A～H号培养基中的子叶节腋芽生长缓慢，I～P号培养基则诱导出大量的不定芽。培养3周后，I～P号培养基中的子叶节仍保持较强活力，芽点继续增多，而A～H号培养基中除了A号和E号培养基中的子叶节保持生长外，其他培养基中的子叶节开始停止生长，不定芽分化系数低。切取长度超过2 cm的不定芽后，其他不定芽的生长加快。比较A～D号和E～H号培养基不定芽分化系数，可以发现过高浓度6-BA对不定芽的分化有一定的抑制作用。I～P号培养基加入0.1 mg/L KT或者0.2 mg/L NAA后不定芽诱导数增加，且让子叶节长时间保持活力，出芽质量较好，可见0.1 mg/L KT和0.2 mg/L NAA均有利于不定芽的生长。I～P号培养基虽然均能诱导出大量不定芽，但是I～L号培养基的不定芽多于M～P号培养基，可见0.1 mg/L KT比0.2 mg/L NAA能更好地促进不定芽的生长。整体来看，J号培养基诱导出芽最多，且生长状态较好，因而本试验中不定芽诱导效果最好的培养基激素配比为1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。

2.2 不定芽生根诱导结果

如表4所示，培养1周后，Ⅰ和Ⅱ号培养基中的不定芽开始长出根，Ⅲ和Ⅳ号培养基中不定芽叶片正常生长，但并未生根，Ⅴ～Ⅷ号培养基不定芽下端全部形成愈伤组织，且不定芽叶片开始发黄。培养2周后Ⅰ和Ⅱ号培养基中的不定芽生根浓密，粗大，Ⅲ和Ⅳ号培养基中也开始长根。培养3周后，生根情况稳定，Ⅳ号培养基中的不定芽生根情况较差，而Ⅴ～Ⅷ号培养基中的子叶节则完全没生根。Ⅰ、Ⅱ号培养基中接种的不定芽生根迅速，根较粗壮。Ⅲ、Ⅳ号培养基中的不定芽生根较为缓慢，且根较为纤细（图1）。可见IBA的浓度过高会抑制不定芽根的形成。而Ⅴ～Ⅷ号培养基中不定芽接种后下端形成愈伤组织，培养两周后愈伤组织生长良好，但不定芽叶片开始发黄脱落，且未生成根，可能是由于NAA加入含量过高引起。本实验中，Ⅰ号培养基中不定芽生根情况最佳，所以此次试验中根诱导效果最好的培养基为MS+0.1 mg/L IBA。

表1 不定芽诱导培养基的激素配比Tab.1 Hormone proportioning of adventitious bud induction medium/（mg·L-1）

表2 生根培养基的激素配比Tab.2 Hormone proportioning of rooting medium /（mg·L-1）

表3 培养时间对不定芽分化系数的影响Tab.3 Impact of culture time on differentiation coefficient of adventitious bud

表4 培养时间对生根率的影响Tab.4 Impact of culture time on rooting rate /%

图1 不定芽生根情况Fig.1 Rooting results of adventitious bud

2.3 再生苗的炼苗与移栽

生根培养3周后获得了一定的再生苗（图2），将其移入装有培养土的培养瓶中，培养1周后，打开培养瓶封口膜，继续培养数周后，移栽苗仍可正常生长（图3）。豆科植物再生困难，成功的例子并不多，炼苗移栽存活率低也是原因之一。此次虽然诱导出再生苗，但是炼苗与移植存活数目较少，暂时难以实现规模化，还需进一步研究提高其存活率。部分再生苗炼苗未成功主要是幼苗太小，根与叶相距q太近，移栽时易导致叶损伤或根未完全埋入土中，且部分根系不够长，未能有效吸收土壤中的营养与水分。后期研究中还需延长再生苗的炼苗时间，增加其存活率。

图2 组培再生苗Fig.2 Regeneration seedlings

图3 移栽苗生长状态Fig.3 Transplanting seedlings

3 讨论与结论

在不定芽诱导过程中先长出的不定芽会对后长出的不定芽产生抑制作用，因而需在适当的时候切除先长出的不定芽。王萍等［12］和李晓梅［10］在豇豆研究中，分别在接种时和培养7 d时切除腋芽，结果表明外植体在进行芽诱导7 d后切除主腋芽，可以减少愈伤组织的形成概率，增加不定芽的生长数量。而本研究也发现类似结果，子叶节诱导出不定芽后，切除长度超过2 cm的不定芽后，其他芽的生长加快。另一方面，子叶节切取的时间和切取时是否携带子叶也会影响不定芽诱导率［13］，本实验采用菜豆不带子叶的子叶节做为外植体，选择种子培养5 d后切取，此时子叶节活性较强，有利于不定芽的分化。

在组织培养过程中，不同激素浓度的配比是影响组织培养效果的重要因素。细胞分裂素可以促进细胞分裂，对外植体分化有很大影响，而生长素可以促进植物生长［14］。曹荣等［15］和聂王星等［16］以6-BA和TDZ组合的培养基诱导大豆子叶节，提高了不定芽诱导率，而本实验在菜豆子叶节的诱导过程中使用6-BA、IBA和KT的组合，对子叶节不定芽诱导也有明显的促进效果。同时，一些营养物质也对植物不定芽增殖有促进作用，商宏俐［17］发现将豇豆种子浸提液加入培养基也能提高增殖率；FRANKLIN等［18］发现用L-谷氨酰胺取代培养基中的无机氮源也能有效提高出芽率。在后期再进一步研究中可尝试添加部分营养物质，以增加菜豆子叶节的芽增殖率。

部分研究表明芽诱导生根时加入IBA或NAA可以增加生根率［19］，而商宏利［17］以豇豆不定芽在不加任何激素的1/2MS培养基上也诱导出了生根苗；单丽辉［20］和刘晓东等［21］在多叶棘豆的生根培养基中加入0.1 mg/L NAA，生根效果非常明显；而本次试验中仅加入0.1 mg/L IBA即可成功诱导出根，而再加入0.2 mg/L NAA的培养基反而使不定芽形成愈伤组织，无法生根，可见选择恰当的激素浓度配比是很重要的。

终上所述，添加不同浓度的IBA、NAA、6-BA和KT均对菜豆子叶节不定芽诱导有一定的促进作用，其中0.1 mg/L KT比0.2 mg/L NAA诱导效果要好，而过高浓度的6-BA会抑制不定芽的生长，综合比较发现最佳芽诱导培养基为MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。添加低浓度的IBA即可成功诱导出根，过高浓度的IBA反而会导致生根诱导率下降，同时添加较高浓度的NAA会导致愈伤组织的形成，无法生根。综合比较发现，最佳生根培养基为MS+0.1 mg/L IBA。本研究通过菜豆子叶节诱导获得了完整的再生植株，成功地建立了菜豆离体再生体系。