铁死亡的机制及其在相关疾病中的意义

兰 斌，龚盛强，成绍武，贺 超，廖 君，葛金文，王国佐*

(湖南中医药大学 1.中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室； 2.医学院, 湖南 长沙 410208)

2012年，在携带RAS突变基因的HT-1080纤维肉瘤细胞模型中，发现erastin(爱拉斯汀)不仅能通过调节线粒体电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)发挥抗肿瘤作用，同时抑制Na+非依赖性胱氨酸/谷氨酸逆向转运体(Xc-)系统重要组成亚单元(SLC7A11)功能，减少胞内谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成的基本原材料，导致铁依赖性脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)的累积增加，诱导细胞死亡[1]。而这种由选择性致死小分子物质erastin触发的新型调节性细胞死亡是被我们先前忽视的类型，即“铁死亡(ferroptosis)”。

1 铁死亡潜在性生物指标

酯酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(Acyl-CoA synthetase long-chain familymember4,ACSL4)是长链脂酰辅酶A(CoA)合成酶(ACSL)家族成员，催化花生四烯酸和肾上腺酸合成为花生四烯酰CoA和肾上腺酰CoA，参与磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等带负电膜磷脂的合成，是脂质代谢途径的重要基因，通过敲除小鼠和人类细胞中ACSL4基因，能有效减少erastin和RSL3诱导的细胞死亡率。与HepG2和HL60等铁死亡敏感细胞相比，ACSL4在抗铁死亡(例如LNCaP和K562)细胞中表达显著下调。应用CRISPR/Cas9实施全基因组筛选和基因芯片分析，发现ACSL4是执行铁死亡发生的关键因素[2]，发挥出细胞保护的巨大潜力。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为GSH还原酶的辅酶，对维持细胞内GSH水平发挥重要作用。通过人纤维肉瘤细胞系、人骨肉瘤细胞系和人横纹癌细胞系等[3]12种不同的细胞系研究铁死亡经典诱导剂(erastin、RSL3和FIN56)作用，胞内NAD(H)和NADP(H)水平均明显降低，并鉴定到脂质代谢下游效应物ROS的形成，而NAD(P)(H)的消耗是脂质过氧化作用的结果，其含量水平可能是监测铁死亡诱导剂敏感性的生物指标。

环加氧酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是催化体内花生四烯酸合成前列腺素(PG)初始步骤中的关键性限速酶。通过建立胶原酶诱导脑出血(ICH)模型小鼠[4]，前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)编码的COX-2在ICH后神经元中高度表达，抑制COX-2功能可减少ICH后的继发性脑损伤，使用liproxstatin-1(铁死亡抑制剂)处理小鼠后，表现出明显的脑保护作用并改善神经功能，为ICH患者提供了潜在临床治疗。

目前，针对铁死亡的研究仍处于初级阶段，深入阐明其在不同临床疾病模型中的生化机制，对相关疾病治疗靶点的确证及药物研发具有重要意义。

2 铁死亡的发生机制及其病理生理意义

铁死亡最显著特征为铁依赖性脂质活性氧(ROS)的是否过载，它将铁死亡发生过程分成上游(ROS产生)和下游(执行铁死亡)两个部分, 主要位于铁代谢途径、Xc-/GPX4途径和脂质代谢途径的交叉处，也受其他通路的共同调控。

2.1 铁代谢途径调控及其意义

铁作为生命必需的微量元素之一，主要以二价和三价铁离子的形式存在于机体内,当小肠吸收或红细胞降解释放出的亚铁离子(Fe2+)经铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CP)氧化为三价铁离子(Fe3+)，同膜上转铁蛋白(transferrin,TF)结合成TF-Fe3+形式，通过膜蛋白转铁蛋白受体1(transferrin receptor protein 1,TFR1)形成复合物内吞入胞体，胞内Fe3+被前列腺6次跨膜上皮抗原3(STEAP3)还原成亚铁离子(Fe2+)，二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter1,DMT1)或锌铁调控蛋白家族8/14(ZRT/IRT-like proteins 8/14,ZIP8/14) 介导Fe2+储存到细胞质中不稳定的铁池(labile iron pool,LIP)内和铁蛋白轻链多肽(ferritin light chain,FTL)与铁蛋白重链多肽1(ferritin heavy chain 1,FTH1)组成的铁储存蛋白复合物中，多余部分亚铁离子则由膜铁转运输出蛋白(ferroportin,Fpn)将Fe2+氧化成Fe3+出胞，参与体内铁再循环，严格把控细胞内铁稳态。

病理状态下，通过研究铁死亡经典诱导剂erastin作用于人类癌细胞，热休克预处理和过表达热休克蛋白B1(heat shock protein B1,HSPB1)可抑制膜蛋白转铁蛋白受体1(TFR1)表达，蛋白激酶C介导的HSPB1磷酸化及铁代谢主要转录因子铁反应元件结合蛋白2(iron response element binding protein 2,IREB2)被抑制，显著增加铁储蛋白亚基铁蛋白轻链多肽(FTL)与铁蛋白重链多肽1(FTH1)表达，降低细胞内亚铁离子浓度和脂质活性氧的产生。而血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)则通过补充细胞内铁离子及产生活性氧，加速erastin诱导的铁死亡[5]。这表明,铁蛋白调控和铁代谢稳态可能成为铁死亡机制的重要调节点。

2.2 Xc-/GPX4途径调控及其意义

胱氨酸/谷氨酸逆向转运体(Xc-)是由机体细胞膜上SLC7A11和SLC3A2两个亚基组成的重要抗氧化体系，可按1:1比例将细胞外胱氨酸摄取入胞内，并被迅速还原成半胱氨酸，参与胞内重要自由基清除剂谷胱甘肽(GSH)的合成。

谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)作为哺乳动物中修复脂质细胞氧化损伤的硒蛋白，将胞内还原型谷胱甘肽(GSH)转化为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，同时将细胞内毒性脂质过氧化氢(L-OOH)转化为无毒脂醇(L-OH)，促进H2O2分解，保护细胞膜结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。 研究发现， 通过敲除小鼠膜脂修复酶-GPX4或直接使用GPX4抑制剂(RSL3)可促进脂质过氧化和胞内活性氧的堆积[6]，而GPX4可能是铁死亡发生的关键调控者。

2.3 脂质代谢途径调控及其意义

铁死亡的灵敏度与脂质代谢失衡密切相关，包含多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的磷脂生物合成，并将磷脂作为酯酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4，脂肪酸代谢介质)和磷脂胆碱酰基转移酶3(LPCAT3，脂质重塑)促脂质过氧化反应的底物，是脂肪氧合酶对多不饱和脂肪酸(PUFA)-磷脂酰乙醇胺(PE)的选择性氧化作用。应用脂质组学研究，含有花生四烯酸(C20∶4)或其延长产物肾上腺酸(C22∶4)的磷脂酰乙醇胺(PE)是脂质氧化作用并驱使细胞朝向铁死亡发生的关键磷脂，而ACSL4和LPCAT3参与多不饱和脂肪酸的生物合成和重塑，通过补充花生四烯酸或其他多不饱和脂肪酸的细胞表现出对铁死亡的高灵敏度[7]，执行铁死亡发生的重要步骤。

2.4 其他途径调控及其意义

此外，通过p62-Keap1-NRF2途径[8]、p53-SAT1-ALOX15途径[9]、ATG5-ATG7-NCOA4途径[10]或谷氨酰胺代谢途径[11]均能有效调控胞内铁离子及ROS的形成，发挥出铁死亡的致死效应。

基于以上分析，铁死亡作为一种铁依赖性脂质过氧化和ROS积累诱导的新型调节性细胞死亡，受到多条生物学途径的有效调控，呈现出“一个中心、两大部分、网络调控”的工作模式(图1)。

3 铁死亡相关疾病研究

铁死亡的错误调控参与多种临床疾病的发生，深入研究铁死亡有助于进一步明确相关疾病机制。

3.1 涉及铁代谢途径的疾病研究

铁死亡参与神经元中铁依赖性氧化细胞死亡形式。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease, HD)均是临床常见的神经系统疾病。通过建立APP/PS1双转基因模型[12]，使用铁螯合剂(desferrioxamine,DFO)处理，激活热休克蛋白B1表达，进而抑制TFR1对铁离子的转入。铁应答蛋白(IRP1和2)和转铁蛋白受体(TFR)表达水平降低，铁输出蛋白铁转运蛋白(Fpn)水平增加，降低细胞内铁离子浓度及ROS的产生，表现出明显的脑保护作用并改善神经功能。

①铁代谢途径； ②Xc-/GPX4途径； ③脂质代谢途径； ④p62-Keap1-NRF2途径； ⑤p53-SAT1-ALOX15途径； ⑥ATG5-ATG57-NCOA4途径； ⑦谷氨酰胺代谢途径

图1细胞铁死亡通路：上游(活性氧产生)和下游(执行铁死亡)
Fig1Cellularferroptosispathway:upstream(reactiveoxygengeneration)anddownstream(executionofferroptosis)

应用青蒿琥酯(artesunate,ART)治疗胰腺导管腺癌(PDAC)时，细胞内铁离子沉积和ROS的产生能被特异性诱导，使用铁死亡抑制剂可有效阻止ART诱导的脂质过氧化。通过调节膜上转铁蛋白受体表达，降低胞内亚铁离子浓度，可增加人类异种移植小鼠肿瘤模型中的erastin抗癌活性[13]。而线粒体铁蛋白(FtMt)作为线粒体中调节铁代谢的铁储存蛋白，其过度表达可显著抑制神经母细胞瘤细胞中erastin诱导的铁死亡发生[14]。

3.2 涉及Xc-/GPX4途径的疾病研究

通过建立GPX4缺失模型小鼠研究铁死亡对海马神经变性、生理性T细胞应答及肾小管上皮细胞的重要性，发现谷胱甘肽/Gpx4轴在预防脂质过氧化诱导的铁死亡中起重要作用，并验证其参与小鼠行为功能障碍[15]、免疫感染[16]、急性缺血性肾病的组织损伤[17]。

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是一种对细胞内胱氨酸缺乏高度敏感的疾病，使用DFO和ferrostatin-1能有效预防胱氨酸缺乏诱导的谷胱甘肽(GSH)减少水平和细胞死亡，限制乳腺肿瘤细胞生长[18]。通过恢复细胞内GSH水平，激活GPX4表达，抑制脂质过氧化和ROS积累，限制了胃癌细胞铁死亡发生[19]。

3.3 涉及脂质代谢途径的疾病研究

5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)作为脂质代谢途径中的重要调节点，通过5-LOX抑制剂抑制小鼠海马神经元(HT22)细胞系中的铁死亡，发挥出神经保护作用。Ferrostatin-1通过抑制膜脂中多不饱和脂肪酸(PUFA)氧化，减少了少突胶质细胞的死亡发生率[20]。

3.4 其他

通过铁死亡自噬途径(ATG5-ATG7-NCOA4途径)控制铁依赖ROS的产生，限制人纤维肉瘤细胞中erastin诱导的细胞死亡。细胞代谢中谷氨酰胺分解作为铁死亡发生的重要途径，抑制体内谷氨酰胺溶解可有效减少缺血/再灌注引起的心脏损伤[21]。

目前，针对铁死亡的研究主要涉及神经系统疾病、肿瘤和缺血再灌注损伤等临床疾病，通过铁死亡抑制剂可有效延缓病情进展和改善临床症状。深入研究铁死亡在疾病中的发生机制，及铁死亡抑制剂的作用途径，可能对防治相关疾病更具有针对性。

4 问题与展望

铁死亡作为近年发现的新型细胞死亡方式，已被研究证明参与多种疾病的发生发展，但目前仍有诸多疑问有待解决：1)如何识别铁死亡下游信号或铁依赖性ROS的执行途径？2)铁死亡期间铁的具体作用是什么？3)是否还存在其他代谢途径的调控？4)目前仍缺乏像细胞凋亡(如caspases家族激活)、自噬(如自噬溶酶体形成)等可直观反映铁死亡的特异性标志物。因此，识别下游信号传导或铁依赖性ROS执行途径，从基因水平和特异性指标角度深入阐明铁死亡机制以区分其他类型的细胞死亡，成为后期研究的重点，而铁死亡机制的明确可为其他涉及铁代谢紊乱、氧化损伤等相关疾病提供新的研究思路和治疗手段，具有重要的临床意义。

传统中药治疗临床疾病发挥出显著疗效，但其作用机制仍不清楚。近期发现，黄芩素(baicalein)可作为一种新型铁死亡抑制剂，且效果显著优于典型的铁死亡抑制剂(Fer-1、甲磺酸去铁胺等)，为传统中医药对铁死亡机制的作用及开发相关药物研究打开了新思路[22]。本课题组前期研究益气活血中药“脑泰方”可通过促进脑缺血大鼠海马区血红素加氧酶-1(HO-1)生成,上调膜铁转运蛋白(Fpn)和下调转铁蛋白受体(TFR)、二价金属离子转运体(DMT1)的表达，减少脑铁沉积,调节神经元铁代谢，发挥脑缺血/再灌注后神经元的保护作用[23-24]。从“脑泰”方调控铁代谢途径着手，深入研究铁死亡机制，有望进一步阐明其在相关疾病中的作用新途径。

细胞的存亡作为机体正常代谢的重要环节，而铁死亡作为一种新型的细胞死亡形式，深入研究并阐明其在相关疾病中的病理生理机制，可为寻找新的药物靶点和临床防治提供新的思路。