沉默FSTL1减少衣霉素诱导软骨细胞内质网应激及细胞凋亡

杨 蓉，王美美*，杨 杨，许 晋，徐晓龑，施 青，刘璘琛

(1.东南大学附属中大医院 风湿免疫科, 江苏 南京 210009；2.南京医科大学第一附属医院 心内科， 江苏 南京 210009)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)作为常见的关节疾病，以关节软骨退行性改变及继发性骨质增生为主要表现，可导致关节软骨损伤，甚至累及整个关节，严重影响患者生存质量[1]。OA发生机制较为复杂，目前尚未完全清楚。软骨细胞作为成熟关节软骨中维持正常生理功能最为重要的细胞，其异常凋亡在OA发病中发挥重要作用[2]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在调控软骨细胞凋亡过程中发挥关键性作用[3]。衣霉素处理软骨细胞是构建OA发病细胞模型的重要方法[4]，主要通过ERS而介导软骨细胞凋亡。卵泡抑素样蛋白1(follistatin-like protein 1，FSTL1)作为分泌性胞外糖蛋白，广泛存在于人体组织，在细胞增殖、分化、凋亡、免疫及炎性反应等多种生理功能中发挥重要作用[5]。本研究拟利用小分子RNA干扰技术特异性沉默FSTL1基因，观察其对衣霉素诱导软骨细胞ERS及细胞凋亡的影响，以及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：衣霉素(Sigma-Aldrich公司)，用无水乙醇制备衣霉素溶液，实验前用含0.5% FBS培养液配制浓度2 μg/mL；DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、Lipofectamine转染试剂盒和Trizol总RNA提取试剂盒(Invitrogen公司)；反转录试剂盒和PCR试剂盒(TaKaRa公司)；siRNA-FSTL1和siRNA-NC序列(上海吉玛制药技术有限公司设计、合成和鉴定)；FSTL1、Bcl- 2、Bax及内参基因引物(上海生工生物公司设计合成)；MTT法细胞增殖检测试剂盒(上海哈灵生物试剂检测中心)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)；兔抗大鼠蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)多克隆抗体、兔抗人葡萄糖调节蛋白78(GRP78)多克隆抗体、兔抗鼠活化转录因子4(ATF4)多克隆抗体和兔抗大鼠C/EBP同源蛋白(CHOP)多克隆抗体(Santa Cruz公司)；兔抗大鼠钙网蛋白(Cal)多克隆抗体(Abcam公司)；兔抗大鼠p-PERK、eIF2α和p-eIF2α多克隆抗体(CST公司)。

1.1.2 动物：普通级新西兰兔，雄性，6周龄，体质量1.2～1.3 kg[南京金陵种兔场，生产许可证：SCXK(苏)2012- 0003]。

1.2 方法

1.2.1 兔软骨细胞分离、培养及分组处理：取兔膝关节软骨，切成1 mm3大小组织块，0.25%胰蛋白酶消化60 min，用0.20% Ⅱ型胶原酶消化4～6 h，离心后，获得软骨细胞。将细胞置于含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，制备细胞悬液，调整细胞为2×105个/mL，接种于培养板中，待细胞汇合度达85%～90%时，将细胞分为：1)空白对照组：不加入任何处理；2)衣霉素组：加入2 μg/mL衣霉素溶液；3)衣霉素+siRNA-FSTL1组：加入2 μg/mL衣霉素溶液同时，利用Lipofectamine转染试剂盒转染siRNA-FSTL1序列：5′-UGCAAAUACUUACGGACU UUU-3′；4)衣霉素+siRNA-NC组：加入2 μg/mL衣霉素溶液同时，用Lipofectamine转染试剂盒转染siRNA-NC序列5′-GCAUCUUGAGAUUUAAUCA-3′。培养48 h后对各处理组进行相关实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖：取各处理组细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞为2×103个/孔，接种于96孔板，待细胞贴壁后，分别于24、48、72和96 h时，加入20 μL MMT(5 mg/mL)溶液，继续孵育4 h，弃去上清，将DMSO 150 μL加入各孔，振荡15 min，待结晶物溶解完全。全自动酶标仪取490 nm波长处对各孔吸光度(A)值进行检测。

1.2.3 流式细胞计量术检测细胞凋亡：取各处理组培养48 h后细胞，胰蛋白酶消化后，离心留取细胞沉淀，重悬后，调整细胞为1×106个/mL，接种于6孔板，过夜后无血清处理12 h，向各组分别加入相应的培养液，24 h后收集细胞，预冷PBS洗涤3次，将预冷乙醇4 ℃下固定5 h，离心留取细胞沉淀，PBS洗涤3次，用结合缓冲液500 μL重悬细胞，将Annexin V-FITC 5 μL加入后，再加入PI 5 μL，避光反应20 min，于60 min内利用流式细胞仪对样品进行检测。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测细胞中FSTL1、Bcl- 2和BaxmRNA含量：取各处理组培养48 h后细胞，加入细胞裂解液进行裂解后，用Trizol总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA的纯度，取A260/A280≥2.80样品完成后续实验。用反转录试剂盒获得模板单链cDNA，以cDNA为模板进行PCR。FSTL1引物：上游为5′-CCTGTG TGTGGCAGTAATGG-3′，下游为5′-TCAGGAGGGTT GAAAGATGG-3′；Bcl- 2引物：上游为5′-CACAAGA GGCCAAGGCTACCT-3′，下游为5′-CAGGAAAGCAG GAAGTCTCAA-3′；Bax引物：上游为5′-ATTGAGA AACGATTTGCCTACA-3′，下游为5′-GGGAAATGG CTTATTCTCCTTTGCTT-3′；β-actin引物：上游为5′-CCTCATGAAGATCCTGACCG-3′，下游为5′-ACCG CTCATTGCCGATAGTG-3′。PCR反应条件：95 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s，连续进行38个循环，每个样品均设置6个平行反应复孔。用2-△△Ct法对各处理组细胞中FSTL1、Bcl- 2及Bax基因相对表达量进行分析。

1.2.5 Western blot检测各处理组细胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达：取各处理组培养48 h后细胞，加入细胞裂解液进行裂解，利用总蛋白提取试剂盒对总蛋白进行提取，用BCA蛋白检测试剂盒对总蛋白纯度进行检测。取25 μg总蛋白，进行SDS-PAGE分离，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温下封闭60 min，分别将加入一抗兔抗大鼠PERK、CHOP、Cal、p-PERK、eIF2α或p-eIF2α多克隆抗体、兔抗人GRP78多克隆抗体、兔抗鼠ATF4多克隆抗体(稀释比例分别为：1∶500、1∶1 200、1∶600、1∶800、1∶1 000、1∶800、1∶200、1∶2 000)，4 ℃下过夜孵育，用TBST洗膜3次，将二抗加入，孵育90 min，用化学发光试剂盒避光反应30 min，拍照，利用Image J图像分析软件对PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白相对表达量进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各处理组细胞增殖情况比较

与对照组相比，衣霉素组、衣霉素+siRNA-NC组和衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞增殖能力被明显抑制(P<0.05)，与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比，衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞增殖能力显著提高(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with tunicamycin group; △P<0.05 compared with tunicamycin+siRNA-NC group图1 MTT法检测各处理组细胞的增殖Fig 1 Cell proliferation in each treatment group was detected by using MTT assay

2.2 各处理组细胞凋亡情况比较

对照组、衣霉素组、衣霉素+siRNA-NC组和衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞凋亡率分别为6.3%±2.8%、27.4%±4.6%、25.5%±3.9%和15.2%±3.7%(P<0.001)；两两比较，与对照组相比，衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组细胞凋亡率均升高，与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比，衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞凋亡率降低(P<0.05)(图2)。

2.3 各处理组细胞中FSTL1、Bcl- 2和Bax基因表达的比较

与空白对照组相比，衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组细胞中FSTL1和BaxmRNA相对表达量均升高，而Bcl- 2 mRNA相对表达量均降低(P<0.05)；与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比，衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞中FSTL1和BaxmRNA相对表达量均降低，而Bcl- 2 mRNA相对表达量均升高(P<0.05)(表1)。

A.control group；B.tunicamycin group；C.tunicamycin+siRNA-NC group；D.tunicamycin+siRNA-FSTL1 group图2 流式细胞计量术检测各处理组细胞凋亡情况Fig 2 Cell apoptosis in each treatment group was detected by using flow cytometry

groupFSTL1 mRNABcl-2 mRNABax mRNAcontrol group1.17±0.111.73±0.121.22±0.07tunicamycin group1.95±0.16*1.24±0.08*1.86±0.13*tunicamycin+siRNA-NC group1.97±0.18*1.25±0.07*1.89±0.15*tunicamycin+siRNA-FSTL1 group1.56±0.13*#△1.43±0.10*#△1.51±0.11*#△

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with tunicamycin group;△P<0.05 compared with tunicamycin+siRNA-NC group.

2.4 各处理组细胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达比较

与空白对照组相比，衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组细胞中PERK、eIF2α蛋白相对表达量均降低，而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白相对表达量均升高(P<0.05)，与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比，衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞中PERK和eIF2α蛋白相对表达量均升高，而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白相对表达量均降低(P<0.05)(表2，图3)。

3 讨论

软骨细胞作为成熟软骨中唯一存在的细胞类型，在维持关节软骨正常功能及损伤修复中发挥至关重要的作用，然而，由于关节软骨中缺少血管及神经，软骨细胞只能靠渗透作用而维持正常代谢，因而对各种刺激较为敏感，易发生损伤及凋亡[6]。ERS作为早期细胞抵御外界有害刺激的适应性反应， 一旦持续则可导致细胞凋亡发生[7]。衣霉素作为天然核苷抗生素，可导致内质网中钙离子紊乱及未折叠蛋白蓄积而导致ERS[8]。本研究显示，衣霉素组软骨细胞增殖被抑制，而细胞凋亡率增加、凋亡相关基因表达异常，说明衣霉素可促进软骨细胞凋亡发生。

表2 各处理组细胞中PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达比较

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with tunicamycin group;△P<0.05 compared with tunicamycin+siRNA-NC group.

图3 Western blot检测各处理组细胞中蛋白表达Fig 3 Expressions of proteins in each treated group were detected by using Western blot

PERK作为存在于内质网的一种膜蛋白，是介导ERS过程的重要信号通路[9]。细胞发生ERS时，PERK与GRP78解离，被磷酸化而激活，通过促使下游的eIF2α磷酸化而减少蛋白合成，减轻内质网负担，但当应激较严重或持续时间较长时，磷酸化的PERK则通过eIF2α促使ATF4大量表达，而ATF4又可促使CHOP大量表达而促使细胞凋亡[10]。本研究显示，与对照组相比，衣霉素组细胞中PERK、eIF2α蛋白相对表达量均降低，而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白表达量均升高，说明衣霉素通过使软骨细胞内钙超载而激活PERK信号通路，促使ERS发生及细胞凋亡。

FSTL1作为存在于细胞外的基质糖蛋白，参与了炎性反应及免疫功能调节，与自身免疫性疾病关系密切[11]。本研究显示，衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞中FSTL1表达量显著降低。提示，软骨细胞中FSTL1被成功抑制。本研究显示，与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组相比，衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞增殖显著提高，细胞凋亡率降低，凋亡促进基因Bax被抑制，而凋亡抑制基因Bcl- 2则表达增加。说明特异性抑制FSTL1表达，可有效抑制衣霉素导致的软骨细胞细胞凋亡。而相比与衣霉素组和衣霉素+siRNA-NC组，衣霉素+siRNA-FSTL1组细胞中PERK和eIF2α蛋白表达量升高，而p-PERK、GRP78、ATF4、CHOP、Cal和p-eIF2α蛋白表达量降低，说明特异性抑制细胞中FSTL1表达，可有效抑制PERK信号通路，从而减少ERS发生。

综上所述，特异性沉默软骨细胞中FSTL1表达可有效减少ERS及细胞凋亡，其机制可能与抑制PERK信号通路有关。