同型半胱氨酸硫内酯-内质网应激途径促进HUVECs黏附

黄宁江，黄 海，姜 卓，黄仕芳，胡昊良

(1.永州职业技术学院 药学系， 湖南 永州 425000； 2.永州市第一人民医院， 湖南 永州 425000；3.湖南师范大学 生命科学学院, 湖南 长沙 410081)

同型半胱氨酸硫内酯(homocysteine thiolactone,HTL)是致心、脑血管病危险因素之一的高同型半胱氨酸血症的主要病理学基础[1-4]，其与冠状动脉病变程度呈正相关[5]。本研究组曾报道[6-7]外源性HTL可致离体和在体大鼠血管内皮舒张功能的损伤。

HTL可显著增加人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内活性氧的含量，后者则影响内质网折叠蛋白的能力，随之引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[4]。ERS在内皮细胞紊乱中起主导作用[8]，由此推测HTL可能引起内皮细胞的ERS，导致内皮细胞紊乱。

人主动脉内皮细胞经同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的预处理后，其黏附因子表达随Hcy的浓度增加而上调[9]。HTL是Hcy的主要衍生物，可能是促内皮细胞黏附的主要因素。内皮细胞黏附是致内皮细胞紊乱及损伤的关键因素，由此推测HTL可能通过ERS致内皮细胞黏附。

1 材料与方法

1.1 材料

人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；普通级SD雄性大鼠体质量(180±20)g (湖南师范大学生命科学学院动物房); NF-κB激活-核转运检测试剂盒(碧云天生物技术公司)；同型半胱氨酸硫内酯、内质网抑制剂(salubrinal)和内质网激动剂(tunicamycin) (Sigma-Aldrich公司); Chop和Bip(Cell Signaling Technology公司);VCAM-1、ICAM-1和GAPDH抗体(Santa-Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:用加入终浓度为1%的青霉素-链霉素、含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基培养HUVECs，1～2 d换1次培养液，待细胞增殖到80%～90%汇合时进行传代培养。取状态良好的细胞用于后续处理。

1.2.2 Western blot检测蛋白:提取各组蛋白，将每组等量蛋白进行SDS-PAGE，电泳后转膜，封闭1 h，分别用Chop、Bip、VCAM-1、ICAM-1和β-actin抗体孵育，4 ℃过夜。TBST洗膜，之后二抗孵育1 h，TBST洗膜，显影和定影。

1.2.3 在体实验:将大鼠随机分为对照组和HTL损伤组，每组6只，将HTL溶解于0.9%氯化钠溶液中，每天灌胃1次(50 mg/kg)。持续8周后，放血处死动物，取大鼠胸主动脉检测NF-κB p65的表达。

1.2.4 细胞实验:取5组长势较好的人脐静脉内皮细胞，分别用不同浓度的HTL(0、0.001、0.01、0.1和1 μmol/L)处理细胞24 h。待24 h后提取蛋白，通过Western blot技术观察内质网应激标记蛋白Bip、Chop及黏附因子标记蛋白VCAM-1和ICAM-1的表达。

取5组长势均匀的HUVECs，用HTL(0.1 μmol/L)分别处理不同时间(0、3、6、12和24 h)。提取蛋白， Western blot技术检测HTL不同时间处理对HUVECs内质网应激蛋白Bip、Chop及黏附因子标记蛋白VCAM-1和ICAM-1的表达影响。

取6组长势均匀的HUVECs分成对照组、HTL(0.1 μmol/L)组、HTL(0.1μmol/L)与内质网应激抑制剂salubrinal(0.1 μmol/L)组、内质网应激抑制剂salubrinal组(0.1 μmol/L)、HTL与内质网应激激动剂tunicamycin组(0.1 μmol/L)、内质网应激激动剂tunicamycin(0.1 μmol/L)组，同时处理24 h。提取蛋白，通过Western blot技术，分别检测内质网应激激动剂与抑制剂对HTL诱导的黏附因子表达的影响。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HTL对血管内皮细胞NF-κв P65表达的影响

与正常组相比，HTL组大鼠血管内皮细胞红色荧光显著增强，表明HTL可以增强血管内皮细胞NF-κB p65的表达(图1)。

2.2 HTL呈剂量依赖性促HUVECs内质网应激

HTL呈剂量依赖性促内质网应激标记蛋白Bip和Chop蛋白的表达(P<0.05)(图2)。

2.3 HTL呈时间依赖性促HUVECs内质网应激蛋白表达

内质网应激标记蛋白Bip和Chop的表达随HTL处理时间的增加而增加(P<0.05)(图3)。

2.4 HTL呈剂量依赖性促HUVECs黏附因子的表达

HTL呈剂量依赖性促HUVECs黏附因子VCAM-1和ICAM-1的表达(P<0.05)(图4)。

2.5 HTL呈时间依赖性增加HUVECs中黏附因子的表达

黏附因子标记蛋白VCAM-1和ICAM-1的表达随HTL处理时间的增加而增加(P<0.05)(图5)。

2.6 内质网应激激动剂与抑制剂对HTL诱导的HUVECs中黏附因子表达的影响

内质网应激激动剂与抑制剂分别促进与抑制HTL诱导的黏附因子的表达(P<0.05)(图6A)。 “STRING”预测出Bip(HSPA5)和Chop(DDIT3)与黏附因子VCAM-1和ICAM-1的相互作用(图6B)。

图1 免疫荧光检测HTL对大鼠血管内皮细胞的影响

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图2 不同浓度的HTL对Bip和Chop蛋白表达的影响Fig 2 Effect on Bip and Chop proteins expression by different concentrations of n=3)

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图3 HTL呈时间依赖性促HUVECs中Bip和Chop蛋白的表达Fig 3 HTL promoted the expression of Bip and Chop proteins in a time dependent manner n=3)

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图4 不同浓度的HTL对VCAM-1和ICAM-1蛋白表达的影响Fig 4 Effect on VCAM-1 and ICAM-1 proteins expression by different concentrations of HTL n=3)

3 讨论

本课题组前期研究证实同型半胱氨酸硫内酯(HTL)可损伤血管内皮功能，导致内皮功能紊乱[10]。非正常的未折叠蛋白反应被称为内质网应激，通常在氧化应激及内皮功能紊乱时发生[11-12]。本实验发现HTL可促进HUVECs中内质网应激标记蛋白Bip和Chop的表达。

内质网应激可诱导血管细胞黏附因子1(VCAM-1)及细胞间黏附因子1(ICAM-1)的mRNA表达，最终导致内皮功能紊乱[13]。本结果显示，HTL可呈时间及剂量依赖性促HUVECs黏附因子VCAM-1和ICAM-1的表达。同时，内质网应激激动剂可上调HTL对黏附因子的表达，内质网应激抑制剂可抑制HTL对黏附因子的表达。本实验利用蛋白相互作用预测工具“STRING”，进一步发现 Bip(HSPA5)、Chop(DDIT3)与黏附因子VCAM-1、ICAM-1具有相互作用，表明HTL可能通过内质网应激途径促HUVECs黏附。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图5 HTL呈时间依赖性促VCAM-1和ICAM-1的表达Fig 5 HTL promoted VCAM-1 and ICAM-1 proteins expression in a time dependent manner n=3)

A.effects of endoplasmic reticulum stress agonists and inhibitors on the expression of HTL induced adhesion; B.interactions between endoplasmic reticulum stress proteins (Bip, Chop) and abhesion molecules (VCAM-1, ICAM-1) predicted by “STRING”;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05 compared with HTL

图6HTL可能通过内质网应激途径促HUVECs中的黏附因子表达

内皮黏附是导致动脉粥样硬化的关键因素[14-15]，HTL致内皮损伤从而促动脉粥样硬化的关键因素可能与其促内皮黏附因子的表达有关。其次，内质网应激是HTL促HUVECs中黏附因子表达增加的关键因素，因此，HTL可能通过内质网应激途径促HUVECs黏附，从而致内皮功能紊乱引起动脉粥样硬化。