评价多种抗原在非典型脊柱结核辅助诊断中的作用

吴仁森，孟晓源，李 坤,，车立新，郭 瑞

全世界大约有三分之一的人为潜伏性结核感染者，约有10%的潜伏性结核感染者会发展成活动性结核患者[1]。结核杆菌最常侵犯的是肺组织，其次是骨与关节，约占肺外结核10%左右。在骨与关节结核中，脊柱结核约占50%左右[2]。由于脊柱结核病灶较深，发病不典型，目前仍没有足够的证据及指南来指导脊柱结核的早期诊断[3]。临床上，有些脊柱结核患者症状不典型，影像学上表现也难以和普通脊柱炎性病变及肿瘤相鉴别，这类脊柱结核被定义为非典型脊柱结核。关于非典型脊柱结核的文献报道较少，多以个案报道的形式出现[4]，因为临床少见，症状及辅助检查不典型，所以常常耽误了患者治疗的最佳时机。血清抗原在结核病辅助诊断方面一直备受研究人员关注，尤其在早期快速诊断方面[5]。热休克蛋白(heat shock proteins，Hsps)作为抗原物质，既可以引起细胞免疫也可以引起体液免疫[6]。该文选取结核杆菌热休克蛋白10(Mycobacteriumtuberculosisheat shock protein 10，MTB Hsp 10)、结核杆菌热休克蛋白60(Mycobacteriumtuberculosisheat shock protein 60，MTB Hsp 60)、热休克蛋白16.3(heat shock protein 16.3，Hsp 16.3)和热休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp 70)4种抗原，通过ELISA技术来评估其在非典型脊柱结核辅助诊断上的价值。

1 材料与方法

1.1病例资料选取2016年2月～2017年3月新疆自治区人民医院脊柱外科收治的疑似非典型脊柱结核患者66例。所有患者行术前穿刺或术后病理检查，或行病灶病原菌培养检查。最终确诊为非典型脊柱结核37例，其中男20例，女17例；年龄16～70(40.8±11.2)岁；脊柱其他疾病26例，其中男14例，女12例；年龄24～57(43.5±10.4)岁；诊断未明确及随访丢失共3例(排除试验)。以上分组由同一主治医师按照一定纳入、排除标准完成。另外选取30例健康体检者做空白对照组，其中男18例，女12例；年龄20～57(39.6±11.3)岁。非典型脊柱结核组纳入标准：① 单节段椎骨结核；② 脊柱附件结核；③ 多节段椎骨结核；④ 无明显骨质破坏，但伴有冷脓肿形成；⑤ 无明显骨质破坏，但病理检查有结核性肉芽肿；⑥ 术前或术后病理检查符合结核改变；⑦ 入院前未经抗结核治疗，入院后经正规抗结核治疗后，患者症状好转或治愈；⑧ 排除合并HIV感染患者；⑨ 全部患者随访≥6个月。脊柱其他疾病组纳入标准：① 排除脊柱结核可能；② 既往无结核病病史，无结核病家族史、接触史；③ 排除合并HIV感染患者。本研究经过医院伦理委员会批准，所有受试人员签署知情同意书。

1.2试剂结核杆菌热休克蛋白(MTB Hsp 10、MTB Hsp 60)和热休克蛋白(Hsp 70、Hsp 16.3)ELISA检测试剂盒由南京森贝伽生物科技有限公司生产提供。

1.3方法自行设计信息采集表对入选受试人员进行信息采集，包括入选人员人口学基本信息，患者临床特征，入院后患者的实验室检验结果。收集受试者静脉血5 ml，室温下静置20 min，3 000 r/min离心20 min，取上清液于-80 ℃冷藏待测。

采用ELISA技术检测血清中热休克蛋白。在酶标包被板上加入标准品，并稀释成不同浓度梯度来设置标准浓度。分别在酶标包被板剩余孔里加样品稀释液和待测血清样本，在37 ℃温箱中温育30 min后用自动洗板机冲洗5次，拍干后加酶标试剂再次温育、洗涤、拍干。在酶标包被板各孔中分别加入显色剂A、显色剂B，混匀后放入37 ℃恒温箱内避光显色15 min。显色结束后在酶标包被板各孔内加入终止液终止反应。用酶标仪以空白孔调零，在450 nm波长下读取各孔吸光度(optical density，OD)值并做记录。

2 结果

2.1入选试验对象临床特征及临床检验结果试验入选了66例疑似非典型脊柱结核患者，随访6～12个月，其中1例最终未明确诊断，2例随访丢失，最终有63例患者完成试验。经最终确诊非典型脊柱结核37例，有32例患者接受手术治疗，5例保守治疗，所有患者接受正规抗结核治疗10～12个月；26例其他脊柱疾病患者中，包括脊柱转移瘤11例，化脓性脊柱炎7例，脊柱原发肿瘤4例，布氏杆菌病4例；30例健康体检者无家族结核病史，无结核病接触史。所有入选对象均接受临床特征信息采集及临床相关检验。见表1。

2.2非典型脊柱结核组患者影像学特征本组37例患者均接受X线摄片和CT或者MRI检查。主要的影像学特征有：① X线片表现为骨质增生、骨赘形成，椎间隙变窄；② MRI可见椎体软骨终板破坏，呈虫蚀样变化；③ 单一椎体中心病变，或者单一椎体压缩性病变；④ 单侧椎弓根破坏或者棘突破坏，可累计多个部位；⑤ 影像学表现与症状不符，影像学表现较重，但患者症状表现不明显。

2.34种抗原血清ELISA检测结果93例受试者均接受4种抗原血清ELISA测定，结果以酶标仪在450 nm波长下读取各孔OD值体现。非典型脊柱结核组、脊柱其他疾病组和健康体检组血清中的4种抗原OD值不全相等(P<0.001)(表2)。非典型脊柱结核组血清4种抗原OD值要比脊柱其他疾病组和健康体检组高(P<0.05)，而脊柱其他疾病组和健康体检组之间4种抗原OD值差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 93例入选试验对象临床特征信息及临床检验结果

表2 4种抗原ELISA血清学检测结果(OD450 nm值

与非典型脊柱结核组比较：*P<0.05

表3 4种抗原及联合诊断AUC、95% CI和约登指数

2.44种抗原及联合诊断对非典型脊柱结核的诊断价值根据4种抗原的OD值绘制四种抗原及联合诊断的ROC曲线(图1)，根据ROC曲线计算4种抗原及联合诊断AUC、95%置信区间(confidence interval，CI)和约登指数(表3)。MTB Hsp 10诊断灵敏度和特异度分别是87%、73%，MTB Hsp 60是89%、75%，Hsp 16.3是70%、84%，Hsp 70是51%、91%，4种抗原联合诊断灵敏度和特异度是89%、98%。

图1 MTB Hsp 10、MTB Hsp 60、Hsp 70和Hsp 16.3四种抗原及联合诊断的ROC曲线

3 讨论

在脊柱结核的早期，脊柱“僵”是一个重要阳性体征[7]。本试验纳入的37例非典型脊柱结核中，有31例出现腰背部肌肉僵硬、钝痛、叩击疼等不适症状。但这些症状不是脊柱结核特有体征，包括低热、盗汗、纳差、消瘦等症状在脊柱化脓性病变和脊柱肿瘤也有发现。影像学检查是脊柱结核诊断中不可或缺的方法，但在脊柱结核诊断中X线片的诊断价值有限，尤其在部分非典型脊柱结核患者X线片上仅表现为骨质增生。CT和MRI在脊柱结核早期诊断中具有一定价值，可发现骨质的细微变化，尤其是MRI在脊柱结核早期诊断上具有很高的敏感性。但最终确诊仍需病灶组织切片或者细菌培养。红细胞沉降率、C-反应蛋白和白细胞计数在感染活动期对结核诊断有一定指导意义，本研究显示非典型脊柱结核组与脊柱其他疾病组比较，红细胞沉降率、CRP等炎性指标较高，但是红细胞沉降率、C-反应蛋白主要反应炎性反应，诊断结核病特异性差。

由于非典型脊柱结核所表现出的症状不典型，往往更容易被误诊，从而延误治疗的最佳时机。如果非典型脊柱结核早期被诊断并参照一般脊柱结核的治疗原则，将会达到和一般脊柱结核相同的治疗效果。所以寻找一种快速、经济、准确的诊断方法非常重要。近年来对结核杆菌抗原上的研究催生了很多对结核疾病新的诊断方法。Hsps是具有调控蛋白降解、耐热、免疫调节等功能的一类抗原蛋白[8]。人在结核杆菌感染过程中，Hsps诱导免疫反应，激活Toll样受体的作用[9]。研究人员利用Hsps这些特性来研究其对结核病诊断作用。

本研究通过ELISA技术检测人血清中两种结核杆菌热休克蛋白(MTB Hsp 10、MTB Hsp 60)和两种宿主热休克蛋白(Hsp 16.3、Hsp 70)在450 nm处OD值显示，非典型脊柱结核患者血清中4种抗原OD值明显高于脊柱其他疾病和健康人。Shekhawat et al[10]通过检测结核患者脑脊液和血清发现，与对照组对比多种热休克蛋白均增高。这种变化反映了宿主对结核杆菌感染的免疫应答，同时也反映了结核杆菌自身对宿主免疫对抗作用[10]。

通过绘制四种抗原的ROC曲线，计算AUC、约登指数、灵敏度和特异度发现，MTB Hsp 60的诊断效率最高，虽然MTB Hsp 10和MTB Hsp 60诊断灵敏度较高，但是Hsp 16.3和Hsp 70的诊断特异性较高。联合4种抗原绘制ROC曲线，计算AUC=0.97，灵敏度和特异度分别为89%和98%，可以认为联合4种抗原对非典型脊柱结核诊断效率要高于任意一种单独抗原。

本研究也有许多不足之处，如纳入样本量较少，结核患者均为成年人，没有纳入儿童非典型脊柱结核患者，Hsps在儿童脊柱结核血清中表达尚不清楚等。总之，运用ELISA技术测定非典型脊柱结核患者血清中特异性抗原的含量是一种简单、快速、廉价的结核诊断方法，MTB Hsp10、MTB Hsp60、Hsp16.3和Hsp70 4种抗原在非典型脊柱结核辅助诊断中具有一定价值。