8q24基因多态性和安徽人群前列腺癌的相关研究

梁前俊，张 力,2，樊 松,2，梁朝朝,2

前列腺癌 (prostate cancer,PCa)是一种常见的男性泌尿系统恶性肿瘤。PCa的病因有很多，从目前的流行病学研究来看，可遗传的基因变异从中起着关键性作用。近年来全基因组关联研究已经发现了许多与PCa风险相关的单核苷酸多态性位点[1]，这对进一步了解PCa提供了新的方向。8q24染色体上的遗传变异已经证明与前列腺、结肠直肠、乳腺、膀胱等部位肿瘤的发病相关[2]。全基因组关联研究[3]显示人类染色体8q24上的几种常见变体与增加PCa的风险密切相关，其中研究较多的3个独立的PCa的风险区域(区域1:128.54～128.62,区域2:128.14～128.28,区域3:128.47～128.54)，rs10090154、rs16901966分别位于8q24区的风险区域1及风险区域2中。该文从基因水平研究8q24上2个SNP位点与安徽汉族人群PCa发病的相关性，并探讨其与年龄、体重指数(body mass index，BMI)、收缩压(systolic blood pressure，SBP)、肿瘤分期、Gleason评分、血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)水平等临床特征的关系。

1 材料与方法

1.1病例资料选取2014年9月～2016年6月安徽医科大学第一附属医院90例PCa患者和139例健康对照者。病例组人群均为PSA≥4 ng/ml、经组织病理学确诊的PCa患者；对照组均为PSA<4 ng/ml、无肿瘤病史和家庭肿瘤病史同期进行常规体检的健康人群。本研究通过安徽医科大学医学伦理审查委员会的审查，按照知情同意原则收集PCa患者与健康对照的血样。同时从患者医疗记录中收取相关临床资料，其中包括诊断年龄、BMI、SBP、肿瘤分期、Gleason评分、PSA水平。

1.2基因分型分析取受试者抗凝外周静脉血2 ml，用全基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)进行DNA提取。对于每例DNA样品，通过MassARRAY法检测rs10090154、rs16901966多态性。从GenBank查取rs10090154、rs16901966附近的基因序列，由Assay Designer软件包进行引物设计并进行引物合成。PCR体系制备：分别取2.8 μl去离子纯水，0.5 μl含0.02 mol/L MgCl2的10×PCR缓冲液，0.4 μl 0.025 mol/L MgCl2，0.1 μl 0.025 mol/L dNTP Mix，1 μl PCR 引物Mix，0.2 μl 5 U/μl DNA聚合酶至1.5 ml管配制PCR Mix，(该体系为单孔反应)分装至384 孔板后，加入1 μl DNA，涡旋震荡和离心。PCR的反应条件：95 ℃预变性2 min、95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min共44个循环，后于72 ℃终延伸5 min。在PCR反应结束时，用碱性磷酸酶(SAP)处理PCR产物以从系统中除去游离的dNTP，碱性磷酸酶处理完成后进行单碱基延伸反应，后将延伸产物用清洁树脂纯化，将纯化的PCR产物送至上海吉凯基因化学技术有限公司测序。

1.3统计学处理采用STATA 12.0软件进行相关统计分析，运用Hardy-Weinberg平衡检验(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)对对照组样本基因型分布频率进行检验，计算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI)来评价相对风险，P<0.05为差异有统计学意义，检验均为双侧。病例组和对照组样本中rs10090154、rs16901966 位点基因型和等位基因频率运用χ2检验进行分析，分层分析及PCa患者相关临床资料差异同样使用χ2检验计算。8q24区rs10090154、rs16901966基因型、等位基因与PCa相关性及PCa患者rs10090154、rs16901966在肿瘤分期、Gleason评分、确诊时PSA浓度的易感性分析结果使用多因素Logistic回归分析经年龄、BMI、收缩压因素进行校正。

2 结果

2.1研究人群的特征所纳入90例PCa患者及139例健康患者的人口特征见表1。患者组年龄48～87(73.00±7.64)岁，对照组年龄60～95(67.66±6.69)岁，两组人群的年龄差异有统计学意义(P<0.001)，两组人群间的BMI指数和SBP差异无统计学意义。本篇rs10090154、rs16901966对照组样本中基因多态性的基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P=0.276、0.559)，说明对照组人群代表性均较好。

表1 病例组和对照组的一般情况

2.28q24基因rs10090154、rs16901966多态性和PCa相关性分析关于rs10090154病例组和对照组多态性基因型分布见表2。总体而言，相对于野生CC基因型，PCa组中CT杂合模型(P=0.001,OR=3.147,95%CI: 1.616～6.127)及CT/TT显性模型(P=0.001,OR=3.008,95%CI:1.572～5.574)基因频率比在对照组中要高；PCa患者的T等位基因频率比对照组高(P=0.006,OR=2.062,95%CI: 1.226～3.467)，提示rs10090154的风险等位基因T与PCa的患病风险呈正相关性。

表2 8q24区rs10090154基因型、等位基因与PCa的相关分析

a：使用多因素Logistic回归分析经年龄、BMI、收缩压等因素校正后的P值；b：使用多因素Logistic回归分析经年龄、BMI、收缩压等因素校正后的OR值

关于rs16901966病例组和对照组多态性基因型分布见表3。相对于野生AA基因型，PCa组中AG杂合模型(P=0.042,OR=1.899,95%CI:1.023～3.524)、GG纯合模型(P=0.008,OR=4.090,95%CI:1.446～11.570)及AG/GG显性模型(P=0.009,OR=2.190,95%CI: 1.217～3.941)基因频率比在对照组中要高；G等位基因的频率在PCa患者要比对照组高(P=0.007,OR=1.737,95%CI:1.160～2.600)，提示rs16901966风险等位基因G与PCa的患病风险也呈正相关性。

表3 8q24区rs16901966基因型及等位基因和PCa的相关分析

a：使用多因素Logistic回归分析经年龄、BMI、收缩压等因素校正后的P值；b：使用多因素Logistic回归分析经年龄、BMI、收缩压等因素校正后的OR值

2.38q24基因rs10090154、rs16901966多态性和PCa相关性分层分析rs10090154、rs16901966病例对照组多态性亚组型分布见表4。rs10090154位点在年龄≤70岁(P=0.002,OR=3.814,95%CI:1.634～8.901)、BMI>23 kg/m2(P=0.001,OR=3.449,95%CI:1.629～7.303)、SBP≥140 mmHg(P=0.008,OR=3.148,95%CI:1.352～7.328)的人群中相对于野生基因型CC，突变基因型CT/TT可能有较高的PCa发病风险；rs16901966位点在年龄>70岁(P=0.024,OR=2.567,95%CI:1.132～5.818)、BMI>23 kg/m2(P=0.029,OR=2.030,95%CI:1.074～3.838)的人群中，突变基因型AG/GG PCa的发病率比野生型AA更高。

2.4PCa患者临床特征与基因型的关联分析将PCa患者按照不同临床分期、Gleason等级和PSA值分别分为2个亚组(局限型和进展型、低级别≤7和 高级别>7、PSA≤20 ng/ml和PSA> 20 ng/ml)，比较病例组中8q24基因rs10090154、rs16901966位点变异型和野生型基因频率的差异，并没有观察到显著的相关性，见表5。

表4 8q24 rs10090154、rs16901966基因型频率和PCa相关性的分层分析

表5 PCa患者rs10090154、rs16901966在肿瘤分期、Gleason评分、确诊时PSA浓度的易感性分析

a:使用多因素Logistic回归分析经年龄、BMI、收缩压等因素校正后的P值; b:使用多因素Logistic回归分析经年龄、BMI、收缩压等因素校正后的OR值

3 讨论

尽管许多研究[4]都表明遗传基因变异多态性和癌症的发生有关，但是对于基因多态性具体怎样影响癌症的发生还不清楚。8q24染色体片段长约600 000 bp,目前发现该区域内有多个SNP位点与癌症的发病风险存在相关性[5]，其中rs10090154、rs16901966就是其中两个位点。

到目前为止，rs10090154基因多态性和许多癌症的关系已经被报道，Cortessis et al[6]在美国人群和中国人群做了一个病例对照研究，探讨rs10090154和膀胱癌的关系，结果提示rs10090154多态性位点可能和膀胱癌的发生无关。Curtin et al[7]在欧洲人群中发现rs10090154和结直肠癌的发生有关，可提高结直肠癌的发病率。rs10090154多态性和PCa的关系也有很多人报道过，其中的结果不尽一致， Benford et al[8]在非洲人群中发现rs10090154多态性和PCa发病无关，张政 等[9]在中国北方人群发现rs10090154和PCa发生无关。而有许多文献[10-12]显示中国人群rs10090154多态性和PCa发病有关，并且能够提高PCa的发病风险。Ren et al[13]在中国人群中做了一项关于rs10090154多态性和PCa发病关联的荟萃分析，结果显示在rs10090154多态性可提高PCa的发病率。在本篇文章病例对照研究的结果提示rs10090154多态性和PCa的存在相关性，与上述荟萃分析的结果一致，Benford et al[8]和张政 等[9]结果的差异可能同种族差异及样本量较小相关。

相对于8q24区rs10090154，关于rs16901966多态性和癌症的关系研究较少，但是在仅有的文章里都是研究该位点和PCa的风险相关性[10-11,14-15]，Zhao et al[11]在中国北方人群中发现PCa 患者rs16901966-G风险等位基因明显高于健康人群; Liu et al[14]发现在中国北方人群中携带rs16901966 非AA型基因PCa的易感性更高，AA 型基因可能为PCa的保护性基因。本研究得出的结论与之一致，即rs16901966-G 等位基因在PCa人群中的分布高于健康人群，G等位基因可能为PCa发病的危险性基因。

本研究同时探讨了8q24 rs10090154、rs16901966位点风险基因和相关临床特征的相关性， rs10090154 PCa发病与变异基因型CT/TT患者的年龄、BMI、SBP有关，提示患者在年龄≤70岁、BMI>23 kg/m2时诱发PCa的风险较大；rs16901966位点在年龄>70岁、BMI>23 kg/m2的人群中，突变基因型AG/GG PCa的发病率比野生型AA更高，以上结果说明PCa的患病和年龄及BMI有关，并且当BMI>23 kg/m2，所研究的两个位点变异基因携带罹患PCa的风险均更高。同时对rs10090154、rs16901966位点变异基因型与PCa患者不同PCa分期、Gleason 评分、PSA相关性进行了分析，并未发现具有统计学意义的结果，此结果和王刚 等[16]分析的结果一致，不同于Liu et al[15]分析的结果，其差异可能与遗传背景、环境因素如饮食、生活方式、环境污染等有关系。