环介导等温扩增法检测结核分枝杆菌的应用

杜伟勤 薛婷 王桂琴

[摘要]目的 建立环介导等温扩增技术（LAMP）检测肺结核患者痰液中的结核分枝杆菌（MTB）基因。方法 以结核分枝杆菌高度保守的16S rDNA为靶基因设计3对特异性引物，收集2017年1～12月临床确诊的肺结核患者痰液89份，非肺结核患者痰液20份以及MTB标准菌株（H37RV），建立LAMP方法，并检测其特异性、灵敏性，以MTB培养结果为金标准，用SPSS13.0数据处理并进行统计学分析。结果 成功建立LAMP检测痰液中MTB的方法，其特异性为100%，灵敏性为50 copies。在临床患者痰液检测中，特异性和灵敏性分别为85.00%、96.63%，与MTB培养结果比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 LAMP检测MTB特异性和灵敏度高，适用于基层医疗单位MTB的快速检测。

[关键词]环介导等温扩增；结核分枝杆菌；检验

[中图分类号] R939.121 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）5（c）-0123-04

Application of loop-mediated isothermal amplification for the detection of mycobacterium tuberculosis

DU Wei-qin1 XUE Ting2 WANG Gui-qin1▲

1.Education and Research Office of Microbiology and Immunology，Shanxi Medical University of Taiyuan City，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China；2.Department of Clinical Laboratory，People′s Hospital of Lvliang City，Shanxi Province，Lvliang 033000，China

[Abstract]Objective To establish the loop-mediated isothermal amplification technique （LAMP） for the detection of Mycobacterium tuberculosis （MTB） gene in the sputum of patients with pulmonary tuberculosis.Methods Three pairs of specific primers were designed based on highly conserved 16S rDNA of MTB as the target gene.From January 2017 to December 2017，89 sputum samples from the patients were with clinically diagnosed pulmonary tuberculosis，20 sputum samples from non-tuberculosis patients and the MTB standard strain （H37RV） were collected.LAMP method was established，and its specificity and sensitivity were tested.The MTB culture results were taken as the gold standard.SPSS13.0 was used for data processing and statistical analysis.Results LAMP was successfully established for the detection of MTB in the sputum.Its specificity was 100% and its sensitivity was 50 copies.In the clinical sputum testing，the specificity and sensitivity were 85% and 96.63% respectively.The results were almost identical with those of the MTB culture，the difference was statistically significant （P>0.05）.Conclusion LAMP has high specificity and high sensitivity in the detection of MTB，which is suitable for the rapid detection of MTB in primary medical institutions.

[Key words]Loop-mediated isothermal amplification；Mycobacterium tuberculosis；Test

結核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是一种生长缓慢、通过飞沫经呼吸道传播引起人类结核病的病原菌。世界卫生组织（WHO）2017年的报告[1]指出，结核病仍然是全球头号传染病，虽然近年来抗结核进展显著，但形势依然严峻。2016年我国新增结核病人89.5万，报告病例78.3万例。根据《中华医学会.结核病分册》对结核病诊断的规定，其诊断方法包括病原学、免疫学、放射学、组织学、分子生物学诊断等，其中病原学诊断是结核病的诊断金标准。但MTB痰涂片检出率低，培养周期长，不利于早期诊断和预防治疗。WHO推荐的PCR法或快速液体培养法需要昂贵设备和严格的实验室条件，广大基层结核病实验室条件尚不能满足此类方法的开展。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）为一种新型的核酸等温扩增方法。这种方法是通过BstDNA链置换聚合酶对目的基因的6个不同区域设计的3对引物（内引物、外引物、环引物）在60～65℃恒温条件下1 h内进行109～1010倍扩增[2-3]。由于其特异性强，扩增效率高，不需要昂贵设备等多方面的优势备受人们的关注。本研究应用LAMP检测方法对临床样本中的MTB 16S rDNA进行扩增，为其在基层医疗机构中应用奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 本实验使用的标本均来源于吕梁市人民医院检验科2017年1～12月收集的标本共89例。提供标本的患者均经痰涂片和胸片检查诊断为结核病。另外收集医院非结核患者标本的痰液20份，作为阴性对照。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者均签订《知情同意书》。MTB标准菌株H37RV由吕梁市疾控中心惠赠。

1.1.2主要试剂与仪器 罗琴培养基（珠海贝索生物科技有限公司），甜菜碱（Sigma公司），Bst大片段DNA聚合酶（NEB公司），DNA Marker， dNTP （大连宝生物工程有限公司），SYBR GreenⅠ（Thermo fisher公司），结核分枝杆菌核酸试剂盒（中山大学迪安基因有限公司），恒温水浴箱（上海精密仪器仪表有限公司），UVP凝胶成像系统（美国BioSpectrum公司）。

1.2方法

1.2.1细菌培养及DNA模板的制备 将痰液分为两份。一份接种于罗琴培养基上；另一份用4%的NaOH污染。按照MTB核酸检测试剂盒说明书提取DNA。

1.2.2 LAMP试验引物 本研究中所用引物是针对MTB 16S rDNA设计3对引物，引物序列参考Pandey等[4]报道。

1.2.3 LAMP反应体系与反应条件 25 μlLAMP 体系包括：外引物（F3和B3）各 0.2 μmol/L，内引物（FIP和BIP）各 1.6 μmol/L，甜菜碱1.6 mol/L，6 mmol/L Mg2SO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U Bst DNA 聚合酶 1 μl、2.5×的buffer，2 μl 模板 DNA。将反应管置于62℃恒温水浴箱内反应 1 h后，于80℃ 10 min终止反应。

1.2.4 LAMP检测的特异度 以MTB H37RV为阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照，以从临床非结核病患者中分离的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、鲍曼不动杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌的DNA为模板进行扩增。分别取5 μl扩增产物，于2%琼脂糖凝胶中电泳后，UVP拍照，出现LAMP 特征性梯状条带为阳性结果，无梯状条带为阴性结果。

1.2.5 LAMP反应的灵敏度 NanoDrop超微量紫外分光光度计对H37RV的DNA定量测定，双蒸水调整浓度至1×108/ul，倍比稀释，以稀释后梯度DNA为模板，进行LAMP扩增，琼脂糖凝胶电泳验证。

1.2.6 LAMP的临床评价 对临床收集的89 例MTB患者的痰液DNA和20例非結核病患者的痰液DNA进行LAMP 扩增，将LAMP扩增结果与罗琴培养基培养结果进行一致性比较。一致性评价：Kappa值0.00～0.40为一致性较差，0.41～0.60为一致性一般，0.61～0.80为一致性较高，0.81～1.00为几乎完全一致。

2结果

2.1 LAMP的特异性

用LAMP检测MTB H37RV与其他非结核病肺炎患者的痰液结果如图1所示，可以看出，只有H37RV有梯度条带出现，其他菌株未出现梯度条带。综上此方法在MTB 检测中具有高度特异性。

2.2 LAMP的灵敏度

将提取的MTB标准菌株的DNA进行倍比稀释，用LAMP进行扩增，结果如图2所示。 从图可知，电泳后的产物呈阶梯状条带，在第8泳道仍可显现，说明LAMP的检测限为50 copies。

2.3 LAMP检测临床标本的部分结果

LAMP检测临床结核阳性标本的部分结果（图3），其中7号和10号未出现扩增条带。可视性检测结果（图4）所示：反应管内液体绿色为阳性，橙色为阴性。

2.4 LAMP的临床评价

对临床收集的89 例 MTB患者的痰液DNA和20例非结核病患者的痰液 DNA进行LAMP 扩增，将LAMP扩增结果与罗琴培养基培养结果进行一致性比较，所得实验结果如表2所示，特异性和灵敏性分别为85.00%、96.63%，对这两种方法经一致性检验后比较，差异无统计学意义（P>0.05），由 Kappa值=0.82可知，两种方法的一致性良好。

3讨论

LAMP技术自2000年日本人发明以来，己经在许多领域得到了很好的发展，如大肠杆菌[5]、沙门菌[6]、金黄色葡萄球菌[7]、螺旋体[8]、支原体[9]、病毒[10-11]等病原生物体的检测文献相继被报道。据国内学者胡宗悦报道[12]，在PubMed上发表的关于LAMP的文献约有1622篇，在CNKI上约为4220篇，可以看出LAMP检测技术已成为一种工具，广泛应用于医疗、动植物、基础、食品水产和环境等方面。与其他技术相比，LAMP检测技术具有以下优势：①LAMP检测技术不像PCR需要变性、退火和延伸等步骤对温度的精确控制，只用一台恒温水浴箱即可完成实验，所用设备廉价、操作简单；②LAMP检测技术针对靶基因设计 4 条引物，再增加2条外引物，可使得其扩增时间缩短到1 h内，极大地提高了扩增效率；③在LAMP 扩增过程中产生大量的焦磷酸根离子，可与SYBR GreenⅠ发生显色反应[13]，可通过观察反应体系颜色变化来快速判断产物的生成。