尼莫地平对慢性高眼压兔外侧膝状体神经元损伤的影响

张新跃，黄 帅，王林洪

(华北理工大学附属医院眼科，河北 唐山 063000)

青光眼是继白内障之后的第2大致盲性疾病，研究显示，全球青光眼患者在2040年将达到11 180万，其特征为进行性视神经损伤和视野缺损[1-2]。视功能的正常维持依赖于视路中各级神经元结构和功能上的完整性及协调性[3-4]。KITSOS等[5]研究发现，青光眼是从视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)、视神经、视交叉、视束、外侧膝状体、视放射到视皮质整个视觉通路的广泛性损伤。本研究通过前房注射复方卡波姆溶液的方法建立兔慢性高眼压模型，选取尼莫地平作为治疗药物，通过免疫组织化学法检测凋亡因子Bcl-2及Bax的表达，探究钙离子通道阻滞剂尼莫地平对慢性高眼压所致外侧膝状体损伤的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物随机选取3月龄健康雄性新西兰白兔18只(华北理工大学动物实验中心提供)，体质量2.0～2.5 kg，眼前节及眼底无异常。相同环境及饲养方法适应性饲养1周后随机分为正常组、损伤组和治疗组，每组6只。

1.2主要试剂及仪器左氧氟沙星滴眼液(珠海联邦制药股份有限公司，国药准字H20020327)，尼莫地平片(天津市中央药业有限公司，国药准字H20043915)，5 g·L-1地塞米松注射液(辰欣药业股份有限公司，国药准字H37021969)，无菌注射用水(中国大冢制药有限公司，国药准字H20044102)，生理盐水(石家庄四药股份有限公司，国药准字H13023200)，甲苯胺蓝(上海容创生物技术有限公司)，40 g·L-1多聚甲醛(江苏世泰实验器材有限公司)，二氨基联苯胺(diamino benzidine，DAB)、Bcl-2/Bax兔单克隆抗体/免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Tono-pen AVIA眼压计(美国强生Mentor公司)；卡波姆940(美国诺誉化工有限公司)。

1.3慢性青光眼模型制备各组兔均以右眼为实验眼，实验前3 d开始点左氧氟沙星滴眼液，每次0.2 mL，每日3次。将0.3 g卡波姆940及5 g·L-1的地塞米松注射液5 mL溶入无菌注射用水95 mL中，配置成3 g·L-1的复方卡波姆溶液(含地塞米松0.25 g·L-1)，正常组不予处理，损伤组、治疗组兔用注射器针头经角膜缘穿刺进入前房抽取 0.2 mL 房水，推入等量的复方卡波姆溶液建立慢性高眼压模型，注入后逐渐出现球结膜充血，角膜雾状混浊，术后3 h测量眼压，均超过2.93 kPa，可见前房轻度加深，瞳孔竖椭圆形，即为造模成功。模型建立后次日开始，治疗组兔每日给予尼莫地平13.2 mg·kg-1(溶于无菌注射用水中)灌胃1次，正常组、损伤组兔每日给予等量生理盐水灌胃1次，连续灌胃4周，每周称1次体质量，调整给药剂量。模型建立后的第1周每日测量眼压，以后每 3～4 d测量眼压1次，对于眼压低于2.93 kPa者给予补充复方卡波姆溶液0.1 mL，剔除眼压高于 6.67 kPa 者及并发症严重者，使高眼压维持至4周。

1.4兔脑外侧膝状体标本制备模型建立4周后各组兔均采用250 g·L-1乌拉坦耳缘静脉全身麻醉，固定四肢，沿颈部前方切开皮肤，钝性分离皮下组织，暴露两侧胸锁乳突肌，自胸骨体切开，顿性分离两侧肌肉组织，沿气管两侧寻找颈总动脉并游离约2 cm，4-0缝线圈套结扎一侧颈总动脉近心端，远心端作“T”形切开，插入灌有生理盐水的留置针并固定，止血钳夹闭另一侧颈总动脉，剪开两侧颈总静脉，灌注生理盐水约500 mL，至两侧颈总静脉流出澄清液体，检查可见舌头、结膜失去血色，改用 40 g·L-1多聚甲醛(500 mL)经输液加压袋加压至300 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)快速灌注15 min(约 20 mL·min-1)，控制流速至10 mL·min-1再缓慢灌注 30 min，完成固定后，用咬骨钳自两侧眶上壁咬开颅骨，小心去除颅骨，取出完整脑组织，立即用40 g·L-1多聚甲醛固定48 h以上。去除大脑半球，选取包含外侧膝状体的中脑组织，经脱水、透明后进行石蜡包埋，切片，贴片。

1.5Nissl染色观察兔外侧膝状体神经元形态切片置于60 ℃烤箱60 min后放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中完成脱蜡，浸入无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、体积分数95%、80%乙醇中，自来水洗涤后将玻片放入湿盒内，滴加预热至50 ℃的甲苯胺蓝染液，在60 ℃温箱中染色20 min，蒸馏水洗去浮色；体积分数95%乙醇分色，显微镜下观察。将切片浸入盛有自来水的容器中蓝化20 min，以尼氏小体显示清晰为宜。无水乙醇进行脱水，二甲苯 Ⅰ、Ⅱ 透明各10 min，滴加中性树胶封片，显微镜观察神经元形态。

1.6免疫组织化学法检测兔外侧膝状体神经元中Bcl-2、Bax表达切片置于60 ℃烤箱中烘烤 60 min 后浸入二甲苯中脱蜡，按照体积分数100%、100%、95%、90%、80%的梯度行乙醇复水，自来水冲洗后滴加H2O2放入湿盒内室温下孵育15 min，去离子水冲洗1次，磷酸盐缓冲液漂洗3次后行高压修复抗原，滴加山羊血清封闭液，放入37 ℃恒温箱中0.5 h，每张切片滴加30 μL Bcl-2、Bax一抗(稀释比例为1600)，4 ℃冰箱孵育过夜，第2天滴加二抗，行DAB显色、苏木精复染、盐酸乙醇分化，经体积分数80%、95%、100%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，细胞质染色呈棕褐色者为阳性细胞，每只兔选取同侧外侧膝状体的5张不连续的石蜡切片，每张切片选取2个 50 μm 高倍视野下计数阳性细胞，阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100%。

2 结果

2.1慢性高眼压兔模型制备结果所有动物实验期间无意外死亡，眼压均介于2.93～6.67 kPa，所有高眼压维持至实验结束，无角膜扩张等不良情况发生。

2.2各组兔外侧膝状体神经元形态正常组兔外侧膝状体神经元细胞核呈淡蓝色，尼氏小体呈深蓝色，细胞大小均匀，排列紧密(图1A)。损伤组兔外侧膝状体多数神经元水肿，体积变大，排列疏松，可见较多尼氏小体溶解甚至消失(图1B)。治疗组兔外侧膝状体部分神经元水肿，排列较损伤组紧密，可见较少尼氏小体溶解(图1C)。

A：正常组兔外侧膝状体细胞，箭头所示为正常尼氏小体；B：损伤组兔外侧膝状体细胞，箭头所示尼氏小体溶解，自核周崩解为细尘状颗粒，着色变浅，部分细胞尼氏小体消失；C：治疗组兔外侧膝状体细胞，箭头所示可见部分尼氏小体溶解呈细颗粒，但细胞着色较损伤组深。

2.3各组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率比较正常组兔外侧膝状体仅有极少量Bcl-2阳性表达神经元(图2A)。损伤组、治疗组兔外侧膝状体可见较多Bcl-2阳性表达神经元(图2B、图2C)。正常组、损伤组和治疗组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率分别为(0.47±0.43)%、(11.42±1.92)%、(18.95±2.46)%，3组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率比较差异有统计学意义(F=792.91，P<0.01)。损伤组、治疗组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率显著高于损伤组，差异有统计学意义(P<0.05)。

A：正常组；B：损伤组；C：治疗组；箭头所示为阳性细胞。

2.4各组兔外侧膝状体神经元Bax阳性细胞率比较正常组兔外侧膝状体仅有极少量的Bax阳性表达神经元(图3A)。损伤组、治疗组兔外侧膝状体可见较多Bax阳性表达神经元(图3B、图3C)。正常组、损伤组和治疗组兔外侧膝状体神经元Bax阳性细胞率分别为(0.51±0.33)%、(20.28±2.20)%、(12.88±1.96)%，3组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率比较差异有统计学意义(F=1 019.11，P<0.01)。损伤组、治疗组兔外侧膝状体神经元Bax阳性细胞率均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组兔外侧膝状体神经元Bax阳性细胞率显著低于损伤组，差异有统计学意义(P<0.05)。

A：正常组；B：损伤组；C：治疗组；箭头所示为阳性细胞。

2.5各组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率/Bax阳性细胞率比较正常组、损伤组、治疗组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率/Bax阳性细胞率比值分别为0.67±0.60、0.56±0.10、1.50±0.28，3组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率/Bax阳性细胞率比值比较差异有统计学意义(F=80.96，P<0.01)。损伤组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率/Bax阳性细胞率比值比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率/Bax阳性细胞率比值显著高于正常组及损伤组，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

青光眼是常见的以视野缺损为特征的不可逆致盲性疾病[6-8]，其致病因素主要为病理性眼压升高，然而，临床上某些眼压控制在正常范围内的青光眼患者，其视野损害仍可进展，对此，有研究者指出，青光眼损害是从视网膜到外侧膝状体乃至枕叶视皮质的一种广泛性损伤，对青光眼的病程进展及临床治疗的研究也从眼球局部逐渐扩展到了整个视路水平[9]。近年来，青光眼的发病机制被认为是脑退行性病变的一种，与帕金森等疾病类似，上下级神经元是一个联系单元，任何神经元损伤都会引起相关联神经的损伤和凋亡[10]。外侧膝状体是RGC纤维在视觉传导通路上投射的重要中继核团，外侧膝状体一方面可以因RGC的损伤而继发一系列损伤，这种损伤是顺行性跨神经元变性的结果，另一方面外侧膝状体的损伤或退变也逆行性损伤RGC，其机制可能是通过氧化损伤和谷氨酸兴奋性毒性所致[11]。所以，在青光眼的研究中，高位中枢外侧膝状体的研究与保护成为热点。

以往有关高眼压外侧膝状体的研究显示，正常外侧膝状体神经元数量较多，轴突排列为条索状，细胞着色均匀，随着高眼压持续时间的延长，外侧膝状体神经元损伤逐渐明显，外侧膝状体神经元数量与正常组相比明显减少，出现大量神经元的空泡化，细胞内可见固缩和碎裂的细胞核，神经元轴突数量减少，轴索走行排列较对照组排列更加混乱没有规则[12]。本实验中正常组兔外侧膝状体神经元尼氏小体染色呈深蓝色，细胞核呈淡蓝色，细胞大小均匀，排列紧密；损伤组造模4周时神经元形状不规则，出现核固缩及尼氏小体溶解，与以往的研究结果基本一致[12]；而治疗组兔外侧膝状体部分神经元水肿，排列较损伤组紧密，可见较少尼氏小体溶解，提示尼莫地平治疗能够在一定程度上减轻损伤。

慢性高眼压损伤时，可见视网膜纤维层水肿，视网膜神经节细胞凋亡[13]，通过上下级神经纤维的投射，即跨神经元变性的原理引起外侧膝状体神经元凋亡。Bcl-2家族蛋白能够调控细胞凋亡程序，Bcl-2 可以通过控制Ca2+通道的开放和关闭，减少Ca2+跨膜运转抑制凋亡，Bax可以与之结合成 Bcl-2-Bax 异二聚体，对抗Bcl-2的作用促进凋亡[14]。Ca2+拮抗剂可以通过抑制内源性Ca2+上调，阻断兴奋性氨基酸所介导的毒性，从而抑制神经元凋亡。尼莫地平是Ca2+通道阻滞剂的代表药物，其能够透过血脑屏障，在脑部缺血性疾病的治疗中取得了良好效果。青光眼的初始损伤与某些中枢神经系统的退行性病变相似，都是发生在神经节细胞的轴突末梢。近年来，有研究者在对青光眼患者的评估中发现，尼莫地平治疗患者的眼部病理改变得到明显改善，由此可以推断出，尼莫地平对青光眼患者的视神经病变具有一定的治疗作用[15]。

本研究结果显示，正常组兔外侧膝状体仅有极少量的Bcl-2、Bax阳性表达神经元，而损伤组、治疗组兔外侧膝状体可见较多的Bcl-2、Bax阳性表达神经元，3组兔外侧膝状体神经元Bcl-2、Bax阳性细胞率比较差异均有统计学意义；其中损伤组、治疗组兔外侧膝状体神经元Bcl-2、Bax阳性细胞率均显著高于正常组，提示慢性高眼压可促进凋亡的发生，造成外侧膝状体的损伤；而治疗组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率显著高于损伤组，Bax阳性细胞率显著低于损伤组，提示尼莫地平可以促进抑凋亡因子Bcl-2的表达，抑制促凋亡因子Bax的表达。另外，3组兔之间外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率/Bax阳性细胞率比值比较差异有统计学意义，其中损伤组兔外侧膝状体神经元Bcl-2阳性细胞率/Bax阳性细胞率比值与正常组比较差异无统计学意义，可能是由于慢性高眼压持续4周时，Bcl-2及Bax表达均增高，提示凋亡状态的存在；治疗组兔外侧膝状体Bcl-2阳性细胞率/Bax 阳性细胞率比值显著高于正常组及损伤组，可能是由于尼莫地平治疗后Bcl-2表达增高而Bax表达降低的结果，提示尼莫地平可以在一定程度上抑制凋亡。

综上所述，本实验提示，慢性高眼压可以引起外侧膝状体神经元的损伤，尼莫地平可在一定程度上促进抑凋亡因子Bcl-2表达，抑制促凋亡因子Bax表达，从而减轻慢性高眼压所造成的损伤。但本实验的周期略短，对于其机制是顺行的跨神经元变性的结果还是药物直接作用于外侧膝状体而发挥的修复作用，仍需进一步研究和探索。