慢性传输型便秘患者肠道微生态特点及结肠次全切除术效果分析

熊万成，张玉松，赫 鹏

(1.新乡医学院第一附属医院普通外科，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院第一附属医院病理科，河南 卫辉 453100)

便秘可见于任何年龄的人群，主要表现为粪便干硬、排便困难及排便次数减少(每周少于3次)[1]。慢性传输型便秘(slow transit constipation，STC)是一种常见的便秘类型，属于功能性肠病[2]。近年来，随着饮食结构、生活习惯的改变，生活节奏加快，以及精神压力增加，功能性便秘的发病率有上升趋势。肠道菌群是调节肠道功能的关键环节，菌群紊乱可导致肠道功能异常，出现腹泻或便秘。本研究对STC患者肠道菌群特点进行分析，并探讨结肠次全切除术的临床疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2015年1月至2017年1月在新乡医学院第一附属医院普通外科住院的STC患者28例为观察组，其中男9例，女19例；年龄 43～67(54.0±3.2)岁；病程5～17(9.4±2.1)a。另选择体检健康者26例为对照组，其中男8例，女18例；年龄45～69(55.0±2.4)岁。2组受试者的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

纳入标准：观察组：符合STC诊断标准[3]；STC病程≥ 5 a，且反复保守治疗效果不佳；近1个月内未服用微生态制剂、抗生素及治疗便秘药物；患者及家属强烈要求手术，签署手术同意书。对照组：无明显消化道疾病及便秘症状；近1个月内未服用微生态制剂、抗生素及治疗便秘药物。

排除标准：有腹部手术史者；因精神心理障碍、神经系统疾病、内分泌或代谢疾病及药物性因素引起的便秘；结肠、直肠、肛门器质性病变。

1.2试剂和仪器粪便DNA 提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，溴化乙锭购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，DNA Marker、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)相关试剂、限制性内切酶AluI购自宝生物工程(大连)有限公司；EC3型凝胶成像系统购自美国UVP公司，Nano Drop 2000紫外分光光度计购自美国Thermo公司，PTC-200型PCR仪购自美国Bio-Rad公司，恒温水浴锅购自上海精宏实验设备有限公司，超纯水系统购自德国Thermo，超低温冰箱购自日本SANYO公司，台式高速低温离心机购自德国Eppendorf公司，电子天平购自上海电子天平仪器厂。

1.3方法

1.3.1治疗方法观察组患者均采用腹腔镜结肠次全切除术治疗。患者全身麻醉，取截石位，脐下 3 cm 做1 cm横切口，气腹针穿刺建立气腹，置入斜30°镜。腹腔镜直视下右下腹置入12 mm套管作为主操作孔，右上腹平脐置入5 mm套管作为辅助操作孔。左侧上、下腹各置入5 mm套管作为副操作孔。沿乙状结肠系膜右侧根部腹膜返折处切开进入Toldt间隙，并向盆腔延长到直肠膀胱(子宫)陷凹，生物夹夹闭肠系膜动、静脉并离断。切开乙状结肠系膜左侧根部，游离乙状结肠。沿逆时针方向游离降结肠及结肠脾曲，于胃结肠韧带解剖游离横结肠至结肠肝区。打开右结肠系膜，拓展右侧Toldt间隙，解剖离断右结肠血管及中结肠血管，游离右结肠至盲肠与升结肠交界处。取右下腹经腹直肌切口，长约8 cm，逐层进腹。于腹膜返折上4 cm弧形切割闭合器离断乙状结肠，肠钳夹闭离断盲肠上 10 cm 升结肠。吻合器完成盲直肠吻和。

1.3.2标本采集2组受试者留取新鲜粪便标本 3～5 g，一部分标本放入无菌离心管，另一部分标本放入装有1 mL无菌甘油的离心管中，均于-80°保存。

1.3.3末端限制性片段长度多态性(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism，T-RFLP)检测肠道细菌群落结构取粪便标本0.5 g，采用Tiangen 粪便DNA 提取试剂盒进行粪便微生物基因组DNA的提取，按说明书进行操作。然后用紫外分光光度计测定提取到的DNA的浓度。采用细菌16S rRNA 特异性引物8F/1492R对样品中的目的基因进行PCR扩增，其中引物8F的5′端带有羧基荧光素标记[4]。采用限制性内切酶AluI对纯化后的PCR产物在37 ℃恒温条件下酶切4 h，然后于80 ℃水浴20 min使酶失活，得到带有标记的不同大小的末端片段(terminal restriction fragments，T-RFs)，然后对酶切片段大小进行检测。根据测序所得T-RFs片段的大小和数量，用Peak Scanner(v1.0)和Gene Marker 2.20 软件对其进行分析，计算不同样品中细菌的多样性和丰富度，细菌的多样性以香农多样性指数表示[5]。

1.3.4肠道细菌丰度检测取保存于甘油中的粪便标本，37 ℃水浴融化后，用无菌枪头和涡旋仪将粪便在甘油中混匀，系列稀释样品到10-4、10-5和10-6，将稀释后的样品分别涂布在选择性培养基上，分别培养乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌、肠杆菌、肠球菌、梭杆菌。每种培养基每个浓度重复3个平板，于厌氧培养箱中37 ℃培养3～5 d，然后进行计数。

1.3.5观察组患者手术前后排便功能监测采用Wexner便秘评分[6]评估排便情况，包括大便次数、困难程度、排空感等条目，评分越高表示便秘越严重。采用ManoScan 360TM胃肠动力学检查系统对观察组患者术前及术后3个月肛管高压带、静息压、最大收缩压和收缩持续时间进行监测。

2 结果

2.12组受试者肠道细菌多样性和丰富度比较结果见表1。观察组患者粪便菌群香农多样性指数和丰富度均明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组受试者香农多样性指数和菌种丰富度比较

2.22组受试者肠道细菌丰度比较结果见表2。观察组患者肠道中乳酸杆菌、双歧杆菌及类杆菌的丰度低于对照组，肠杆菌、肠球菌及梭杆菌的丰度高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 2组受试者肠道细菌丰度比较

2.3观察组患者手术前后排便功能比较结果见表3。观察组患者术后3个月Wexner便秘评分低于术前，肛管高压带、静息压、最大收缩压和收缩持续时间高于术前，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 观察组28例STC患者手术前后排便功能比较

注：1 mmHg=0.133 kPa。

3 讨论

功能性便秘是指除外肠道或全身器质性疾病及药物性因素所引起的便秘[7-8]，严重影响患者的生活质量。目前，功能性便秘的发病原因尚未完全明确，已知其发病可能与纤维素、水分摄入不足、肠道平滑肌肌张力降低、肠蠕动受机械性阻碍以及排便肌群活动障碍有关。

肠道微生物是指在肠道这个特殊微生态环境内寄居的全部微生物，包括细菌、真菌、病毒、原生动物等，而细菌种类最多，可达1 000～1 150种，其中主要有拟杆菌属、梭菌、乳杆菌、大肠埃希菌，绝大多数为厌氧菌，数量超过1 014，约为人体细胞的10倍。肠道菌群对宿主的物质代谢、消化吸收和免疫防御均可产生影响，且互相制约、互相依存，形成一个相对稳定的生态平衡，参与机体的多项生理活动[9]。有研究显示，菌群紊乱会诱发和加重排便异常，且慢性便秘患者存在肠道菌群紊乱[10]。

大肠各部位内容物和粪便的细菌群落结构相似，个体差异较小肠小，适合通过粪便取样进行大肠部位特别是结直肠的肠道微生态与某些疾病的相关分析。本研究采用T-RFLP检测技术对粪便细菌的多样性和丰富度进行分析，发现STC患者粪便细菌多样性和丰富度均显著降低。观察组患者肠道中乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌数量少于对照组，肠杆菌、肠球菌、梭杆菌多于对照组。肠道微生态参与便秘发生和发展的机制尚不清楚，但在乳酸杆菌、双歧杆菌等肠道优势菌群中，双歧杆菌可酵解寡糖等产生醋酸和乳酸，使粪便连续不断地推向肛门，促进肠道运动，促使大便排出体外。而在肠道菌群平衡被打破后，双歧杆菌等常住厌氧菌数量减少时，大肠中可大量堆积难以消化的寡糖，进而导致患者出现便秘、腹胀等症状。

对于症状严重、病程长、保守治疗效果不佳的STC患者，结肠次全切除是较为有效的治疗手段。本研究显示，结肠次全切除术后患者便秘症状明显改善，Wexner便秘评分显著降低，肛管高压带、静息压、最大收缩压和收缩持续时间显著升高。结肠次全切除术的优势包括：(1)保留盲肠，有助于控制食糜进入结肠的速度和正常粪便形成，且保留了制造短链脂肪酸的结肠菌群和未消化的淀粉，有助于维持维生素、电解质和正常水分的吸收；(2)该术式可切除最为显著的Cajal间质细胞部分，效果显著，患者接受度高[11]。

综上所述，STC患者的结肠菌群紊乱，菌群多样性和丰富度均显著降低。结肠次全切除术可有效改善STC患者的临床症状，可作为STC患者的有效外科治疗手段之一，但其远期效果有待于进一步随访观察。