白桦BpERF1和BpERF2基因的克隆与表达模式分析

赵雅彬，张 博，胡 林，袁 浩，朱俊勇，孙丽芳，张文慧

（黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆 163319）

AP2/ERF（APETALA2/ethylene responsive element binding factor）家族转录因子是植物特有的一类转录因子，在调节植物生物和非生物逆境反应中发挥重要作用[1-2]。在籼稻和粳稻基因组中分别鉴定出170和189个AP2/ERF家族基因，在拟南芥中共鉴定出176个[3]。目前，已报道的多数ERF家族成员被干旱、盐碱、低温、病害、机械损伤等逆境或乙烯（ET）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）等内源激素所诱导，参与不同信号途径的调控。Xu Z.S.等[4]提出了植物在高盐、干旱、低温、病害及虫害胁迫下的信号转导途径；Song X.M.等[5]在AP2/ERF家族鉴定出214个白菜和拟南芥的同源基因，并且构建了这些同源基因互作的调控网络，发现7个CBF基因和4个AP2基因参与冷胁迫诱导的调控途径；大麦HvRAF基因被乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯、高盐和病害所诱导[6]；水稻OsEBP-89基因可以被高盐和2，4-D胁迫所诱导[7]；番茄TSRF1基因的表达受乙烯、水杨酸及病害的诱导[8]。

ERF转录因子参与多种生物学过程，如次生代谢，根、花、种子的发育，尤其是ERF基因具有抗逆能力并调控多种抗逆途径[9-12]。Xu Z.等[13]从小麦中分离出TaERF1基因，该基因可以被盐、干旱、低温及ABA等诱导表达，在转基因植物体内过表达该基因可以激活PR、COR/RD等抗逆相关基因的表达，同时提高转基因植株的抗逆能力；Jin L.等[14]从棉花中克隆到GhERF4基因，该基因可以被乙烯、盐、干旱及冷胁迫所诱导，对该基因的启动子进行分析，发现其中有一些可以被逆境胁迫诱导的顺式作用元件，表明该基因可以被乙烯、ABA及逆境胁迫所诱导参与并调控多种抗逆途径；拟南芥AtERF71/HRE2基因可以被NaCl、甘露醇以及ABA显著诱导，过量表达AtERF71/HRE2基因的拟南芥植株与对照相比耐盐及耐旱能力增强而且在盐胁迫下ROS水平也低于对照植株[15]；辣椒的CaAIEF1基因可以提高辣椒对ABA及干旱的抗性[16]；野生大豆GsERF71基因可以提高拟南芥植株的耐碱性[17]。

目前，关于AP2/ERF转录因子的表达模式和功能解析在某些作物中已有报道，如拟南芥、烟草、水稻、大豆等，但是在木本植物中的研究相对薄弱，如Yao W.J.等[18]研究了小黑杨ERF基因在多种非生物胁迫下的表达；过量表达杨树ERF76基因可以提高烟草对盐胁迫的抗性[19]；对桑树VIIERF基因进行生物信息学分析及表达分析[20]。对白桦ERF基因的研究则鲜有报道，目前只有Zhang W.H.等[21]研究了白桦BpERF11基因对盐和干旱胁迫的抗性。白桦（Betula platyphylla）为桦木科桦属植物，为落叶乔木，生长速度快、耐寒能力强，是我国北方地区重要的森林天然更新树种，特别是近年来，白桦因其树型、叶形叶色和树皮等方面的观赏价值，也成为北方城市园林绿化的重要景观树种。因此，发掘白桦ERF基因并对基因的抗逆能力进行鉴定和验证可以为白桦的抗逆分子育种提供理论依据。本实验从白桦转录组数据库中找到2条ERF基因，并对该基因进行了生物信息学分析及在胁迫下的表达模式分析，为白桦抗逆育种提供重要基因源和理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料及处理

本实验所用材料为野生白桦种子。将野生白桦种子均匀撒播于黑土、蛭石、珍珠岩3∶2∶1的基质中。培养于平均温度为24℃、相对湿度为70%～75%、光照周期为14 h光照/10 h黑暗的温室中。将出苗2个月左右的幼苗分别用200 mmol/L NaCl和20%PEG-6000进行根部胁迫处理，分别在 3、6、12、24和48 h对根、茎、叶进行取样，在液氮中速冻后于-80℃冰箱中保存。

1.2 实验方法

1.2.1 白桦RNA的提取及cDNA的合成

通过CTAB法提取植物的总RNA，cDNA反转录使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒，操作过程按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 白桦ERF基因的生物信息学分析

从白桦转录组数据库中选出2条ERF家族基因，进行序列比对并用NCBI网站的ORF Finder工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定 2个白桦ERF基因的完整开放阅读框，命名为BpERF1（Genbank ID：KM980445）和 BpERF2（Genbank ID：KM980446）；对BpERF1和BpERF2基因进行克隆，所用引物见表1；使用在线工具pI/Mw（http：//web.ex pasy.org/protparam/）分析编码蛋白的相对分子质量、等电点等理化性质；使用在线软件NLStradamus（http：//www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/）预测蛋白的核定位信号；使用在线软件NCBI Conserved Domain Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对蛋白保守结构域进行分析；使用Bioedit软件进行多重序列比对；系统进化树用MEGA 6.0软件构建；使用 SWISS MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）在线程序进行蛋白的三维结构预测。

1.2.3 RT-PCR分析

RT-PCR分析所用引物通过NCBI网站的Primer Blast工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blas）进行设计，内参基因为白桦Tubulin和Ubiquitin基因，以胁迫处理的白桦根、茎、叶组织的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析，每个样品设3次生物学重复和3次平行样重复。20 μL反应体系：10 μL 荧光染料、2 μL cDNA、1 μL 混合引物、7 μL H2O。反应程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 12 s，58 ℃30 s，72 ℃ 45 s，40 个循环。基因的表达量采用 2-ΔΔCt法计算，相对表达量用log2转换[22]。反应所需引物见表2。

表1 克隆BpERF1和BpERF2基因所用引物Table1 primers used for PCR amplification of BpERF1 and BpERF2 genes

表2 RT-PCR分析所用引物序列Table2 Primers used for real time RT-PCR

2 结果与分析

2.1 ERF基因的cDNA序列分析

生物信息学分析结果表明BpERF1和BpERF2基因的cDNA序列长度分别为939 bp和687 bp（见图1），分别编码312和228个氨基酸；预测蛋白分子量分别为76.75和55.94 kD，等电点分别为5.05和5.11。核定位信号预测结果显示BpERF2基因含有2个核定位信号，BpERF2基因含有1个核定位信号。

图1 BpERF1和BpERF2基因PCR产物电泳检测Figure1 Electrophoresis detection of PCR products of BpERF1 and BpERF2 genes

通过NCBI网站的Blast工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比较BpERF1和BpERF2基因的序列相似性，如图2所示，两个基因的同源性为43%。

2.2 ERF基因的蛋白序列分析

搜索SMART网站进行蛋白质结构功能域分析，结果显示BpERF1和BpERF2这两个蛋白均含有1个典型的由60个氨基酸组成的AP2/ERF保守结构域。将这2个AP2/ERF结构域提交到SWISS MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）在线程序，BpERF1 和 BpERF2 分别以 AtERF1（PDBID：3gcc.1.A）和 AtERF1（PDBID：1gcc.1.C）分子模型为基础进行三维结构预测，结果显示这两个结构域均含有3个反向平行的β折叠和一个α螺旋，2条蛋白的保守结构域相似（见图3）。

2.3 ERF基因的同源性及进化分析

2.3.1 ERF基因保守结构域的同源性比对

在Tair数据库查找22条拟南芥ERF基因，借助NCBI数据库软件确定2条白桦和21条拟南芥ERF基因的保守序列，并使用Bioedit软件对23条ERF基因的保守序列进行多重序列比对，结果如图4所示。

多序列比对结果显示，白桦BpERF1和BpERF2基因的保守序列与拟南芥的ERF家族基因的保守序列都具有1个AP2保守结构域，说明他们都属于AP2/ERF转录因子家族中的ERF家族，并且白桦和拟南芥ERF基因的保守结构域具有较高的同源性，它们的β折叠和α螺旋结构序列见图4。白桦BpERF1和BpERF2基因保守序列的14和19位氨基酸相同，都是丙氨酸（A）和天冬氨酸（D），这与拟南芥的 AT4G11140.1、AT4G23750.1、AT1G68550.1等基因是一致的，说明他们属于ERF家族的ERF亚家族，而保守序列的14和19位氨基酸为缬氨酸（V）和谷氨酸（E）的基因如拟南芥的AT1G46768.1、AT2G23340.1、AT5G52020.1等基因则属于ERF家族的DREB亚家族成员。

图2 BpERF1和BpERF2基因的序列相似性分析Figure2 Sequence similarity analysis of BpERF1 and BpERF2 genes

图3 BpERF1和BpERF2蛋白的三级结构预测模型Figure3 Tertiary structure models predicted of BpERF1 and BpERF2 proteins

图4 白桦和拟南芥ERF基因保守结构域的同源性比对Figure4 Conserved domain homology alignment of white birch and arabidopsis ERF genes

2.3.2 ERF蛋白的系统进化分析

以拟南芥AP2/ERF转录因子的分类为基础[23]，利用MEGA7.0软件对BpERF1、BpERF2蛋白和拟南芥、水稻、大豆、油桐、苹果、李、樱桃的ERF蛋白构建进化树（见图5）。结果表明，BpERF1和BpERF2都属于ERF亚家族成员，BpERF1属于B-2组，与苹果的NM_001320016.1蛋白亲缘关系最近，BpERF2属于B-4组，与油桐的KX868935.1蛋白亲缘关系最近，对于苹果的NM_001320016.1和油桐的KX868935.1基因功能尚未有研究报道。

2.4 白桦ERF基因的表达分析

通过RT-PCR对盐和干旱胁迫下白桦BpERF1和BpERF2基因在根、茎、叶中的表达量进行检测，如图6所示。

在NaCl胁迫下，BpERF1和BpERF2基因在根、茎、叶中的表达模式存在差异。BpERF1基因在根中的相对表达量与对照相比呈上调表达的趋势，并且在48 h的变化趋势为先增加后降低，在12 h相对表达量最低，随后又呈现上升趋势，在胁迫48 h时相对表达量最高，为对照的22.15倍。BpERF2基因在根中的表达与对照相比呈下调表达的趋势，只有在12 h时相对表达量高于对照，其余时间点表达量均低于对照。BpERF1基因在茎中的相对表达量呈上

调表达趋势，但表达量明显低于根，各时间点的相对表达量变化不大。BpERF2基因在茎中完全呈现下调表达趋势，相对表达量最低的是6 h，只有对照表达量的0.08倍。BpERF1基因在叶中的相对表达量也呈上调表达趋势，表达量介于根和茎的表达量之间，最高相对表达量出现在胁迫48 h，表达量为对照的3.97倍。BpERF2基因在叶中依然呈下调表达的趋势，只有在24 h时相对表达量高于对照（见图6）。

图5 白桦和其他植物ERF基因的系统进化分析Figure5 Phylogenetic analysis of white birch with other ERF genes

图6 NaCl和干旱胁迫下白桦BpERF1和BpERF2基因在根、茎、叶中的表达模式分析Figure6 Expression pattern of BpERF1 and BpERF2 genes in roots，stems and leaves under NaCl and PEG stress

在PEG胁迫下，BpERF1基因在根中的表达与对照相比呈上调表达的趋势，并且在48 h的相对表达量最高，为对照的6.84倍。BpERF2基因在根中的表达与对照相比呈下调表达的趋势，在6 h的相对表达量最低，只有对照的0.05倍。BpERF1和BpERF2基因在茎中的相对表达量均呈下调表达趋势，但BpERF2基因表达量明显低于BpERF1基因，BpERF2基因在48 h的相对表达量仅为对照的0.01倍。BpERF1基因在叶中的表达呈现出先下调表达后上调表达的趋势，BpERF2基因在叶中依然呈下调表达的趋势，在6 h时相对表达量达到最低（见图6）。

3 讨论与结论

通过序列比对发现白桦的BpERF1和BpERF2基因属于ERF家族的ERF亚家族，ERF亚家族成员可以识别GCC盒（AGCCGCC），在植物抵抗生物胁迫过程中发挥重要的作用[24]。BpERF1和BpERF2均含有1～2个核定位信号，这与前人的结果一致，说明ERF蛋白在细胞核中进行转录调控。BpERF1基因属于B-2组，拟南芥的B-2组共包含5个ERF基因，分别是 At2g47520（AtERF71）、At3g16770（AtERF72）、At1g72360（AtERF73）、At21g53910（AtE RF74）、At3g14230（AtERF75），研究发现该组基因对植物的病害、低氧及渗透胁迫具有调控作用[15，25-26]。BpERF2基因属于B-4组，拟南芥的B-4组共有8个ERF基因（AtERF108-AtERF115），目前对它们的功能研究较少，Zhu Q.的研究结果[27]表明RAP2.6（AtERF108）应答ABA、盐和干旱胁迫。与BpERF1和BpERF2基因同源性最高的苹果NM_001320016.1基因和油桐KX868935.1基因功能则未有报道。前人的研究结果表明ERF转录因子参与多种生物学过程，尤其是具有抗逆能力并调控多种抗逆途径，但是对白桦ERF基因的研究则很少，目前只有Zhang W.H.等[21]研究了白桦BpERF11基因的抗盐耐旱功能，BpERF11基因可以通过调控SOD、POD、LEA等防卫反应相关基因的表达对高盐和干旱胁迫起负调控的作用。BpERF1、BpERF2和BpERF11基因都可以被高盐和干旱胁迫所诱导，但表达模式上有所差异，BpERF11基因在胁迫下呈上调表达趋势，而BpERF1和BpERF2基因在茎和叶中多数表达量很低或呈下调表达趋势，说明BpERF1和BpERF2基因可能与BpERF11基因参与不同的调控途径来调控逆境胁迫；BpERF11蛋白保守序列的14和19位氨基酸为缬氨酸（V）和谷氨酸（E），属于DREB亚家族A-5组，而BpERF1和BpERF2蛋白保守序列的14和19位氨基酸相同，都是丙氨酸（A）和天冬氨酸（D），分别属于ERF亚家族的B-2和B-4组，前人的研究结果表明位于第2个β折叠中的第14、19位的2个氨基酸残基的差异，决定这类转录因子与不同的顺式作用元件的特异结合，BpERF11基因可以和G-box和DRE元件结合，而BpERF1和BpERF2基因可以与哪些元件结合需要通过进一步实验证明[28]。根据以上的研究结果推测BpERF1和BpERF2基因参与植物对生物和非生物胁迫的应答，但参与的逆境调控途径可能与BpERF11基因不同。

本试验对白桦的BpERF1和BpERF2基因在高盐和干旱胁迫下的表达模式进行分析，结果发现2个ERF基因均可以不同程度地被高盐和干旱胁迫所诱导，但不同ERF基因在胁迫下的表达模式存在差异，比如，BpERF1基因在NaCl胁迫下与对照相比呈上调表达趋势，而BpERF2基因的表达量则低于对照；并且ERF基因的表达具有组织特异性，比如，在NaCl胁迫下BpERF1基因在根和叶中呈现明显上调表达，但在茎中表达量则和对照没有明显差异，而在PEG胁迫下BpERF2基因在根、茎和叶中均呈现出明显的下调表达趋势。前人的研究结果表明水稻的OsAP25基因在NaCl胁迫下表达量明显上升[29]。M.K.Sharma 等[30]发现在 NaCl胁迫下 SlERF9、16、26、30、68和 80基因被高度诱导表达，而基因SlERF 4、5、14、21、50、51 和 73 则呈下调表达趋势，本实验与前人的研究结果一致，说明胁迫条件下不同ERF基因的表达具有时间与空间的特异性。BpERF1和BpERF2基因在胁迫下的表达模式不同，说明它们可能通过不同的调控机制来应答逆境胁迫，具有进一步研究的价值。