2011－2013年河南省沙门菌污染分布状况及其耐药研究

穆玉姣,张白帆,李 懿,赵嘉咏,尤爱国,夏胜利,黄学勇,许汴利

沙门菌是引起食源性疾病的重要病原菌,全球 每年发生食源性疾病病例高达数亿人.沙门菌在自然界广泛存在,主要是受感染的动物,包括哺乳动物(猪、牛、羊、马、狗等)、家禽(猪、鸡、鸭、鹅)、爬行类(龟、蛇)等.各种肉类及肉制品、禽类及禽蛋制品都可以在制作、储存、运输、销售过程中被污染而引发食源性病例.我国每年约3亿人因沙门菌感染人而患病,占病原菌食源性疾病总数的70%～80%[1].此外,由于抗菌药物在临床中的广泛使用和畜牧业中作为促生长剂的大量使用,沙门菌分离株的耐药性在全球范围内逐渐上升.因此,很有必要对河南省沙门菌污染分布状况进行调查分析,对2011－2013年从生熟食品、厨具和动物粪便等4 488份标本中分离的332株沙门菌进行了血清学和抗生素耐药性研究,分析河南省沙门菌的流行状况、菌型分布、危险因素与耐药等流行特征,为制定食源性疾病的防治对策和措施提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2011－2013年按照项目要求,在河南省周口市、济源市、商丘市区、商丘睢县、郑州登封和郑州中牟县的菜市场、饭馆、动物养殖场采集生熟食品、厨具和动物粪便等各类标本共4 488份:其中鸡粪512份、猪粪480份、生鸡肉473份、生猪肉461份、熟猪肉441份、熟鸡肉318份、熟鸭肉267份、生牛肉207份、熟牛肉197份、苍蝇189份、熟菜菜板176份、生豆腐146份、鸭粪129份、水产品(包括淡水螺、生虾、鲈鱼肠、鲈鱼内脏、鲈鱼体表、螺狮内脏、甲鱼体表、中华鲟体表、牛蛙体表、三枪鱼体表、圣子体表、青虾体表等)113份、生羊肉104份、羊粪101份、凉菜(包括凉拌腐竹、水煮花生、螺丝、凉拌黄瓜等)93份、熟羊肉81份.动物粪便及标本表面涂抹物使用Carry-Blair运送培养基采集保存,经过亚硒酸煌绿增菌液(SBG)(36±1)℃增菌16 h、沙门菌显色分离培养、系统生化鉴定;食品类样本采样要求及分离培养按照食品安全国家标准GB4789.4-2011进行;共分离出332株沙门菌.

1.2 试剂与仪器 Carry-Blair运送培养、缓冲蛋白胨水(BPW)、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液购自北京陆桥,SBG购自美国BD公司,沙门菌科玛嘉鉴定培养基为法国CHROMAgar,肠杆菌科细菌鉴定板条API20E购自法国梅里埃公司,沙门菌诊断血清购自丹麦SSI公司,脑心浸液/M-H琼脂及药敏纸片为英国OXOID、药敏纸片分配器购自英国OXOID公司.

1.3 菌株的生化鉴定与血清分型 样品在SBG中增菌培养,第2 d转沙门菌显色培养基科玛嘉培养基上,挑取紫色、淡紫色菌落转种脑心浸液平板上37℃过夜培养;使用API20E进行系统生化鉴定.参照考夫曼-怀特沙门菌属抗原表诊断沙门菌血清型,先做O相血清凝集分型,后用软琼脂(参见WHO沙门菌鉴定手册)进行相位诱导,再进行H相(1/2相)血清凝集,使用生理盐水做阴性对照.

1.4 药敏试验 按美国临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐的Kirby-Bauer琼脂法进行[2],选用大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株.

1.5 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件分析数据,通过χ2检验分析药物敏感性,以P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结 果

2.1 沙门菌检出情况 4 488份标本共分离出332株沙门菌,分离率为7.40%(332/4488)出自18种食品及动物粪便.其中从生鸡肉中检出的沙门菌最多79株,检出率为16.70%(79/473);其次生猪肉检出65株,检出率为14.09%(65/461);鸡粪检出57株,检出率为11.13%(57/512),猪粪检出47株沙门菌,检出率为9.79%(47/480).

表1 外环境中的沙门菌检出情况Tab.1 Detection of Salmonella in the external environment

2.2 血清分型 共分离到332株沙门菌,可分为39种血清型,每年血清型的分布及种类也不相同(图1).菌株均为常见的A～F群,分别为O∶4(B)群166株,O∶7/8(C)群39株,O∶9(D)群87株,O∶3,10/1,3,19(E)群34株,O∶11(F)群4株,O∶13(G)群1株,O∶28(M)群1株.39种血清型中最常见的血清型是肠炎沙门菌23.79%(79/332),德尔卑20.18%(67/332)、鼠伤寒10.84%(36/332)、印第安纳7.22%(24/332)、4,5,12:i:-和阿贡纳4.81%(16/332),这些血清型占沙门菌分离株的71.69%(238/332),见表2.

2.3 耐药特征 对分离出的332株沙门菌进行13种抗生素药物敏感性试验,发现沙门菌对三代头孢类和喹诺酮类抗生素较敏感,对头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶的耐药率为7.53%、1.51%、1.81%;对环丙沙星和诺氟沙星的耐药率为8.73%、8.43%;对氨苄西林、四环素和萘啶酸的耐药率较严重,耐药率分别 为 42.47%、57.53%、55.42%.但 通 过 对2011—2013年沙门菌耐药率统计分析发现,沙门菌对头孢噻肟、庆大霉素、头孢吡肟、甲氧胺嘧啶、环丙沙星、链霉素、萘啶酸、诺氟沙星、复方新诺明的耐药率有统计学意义,说明不同年份的耐药率有统计学差异(表3).332株沙门菌中有174株(52.41%)为多重耐药菌(表4).

图1 2011－2013年环境中沙门菌血清分型Fig.1 The serotyping of Salmonella from environment In 2011－2013

表2 环境中沙门菌菌株宿主－血清分布情况Tab.2 Host and Serotyping of Salmonella isolate from environment

表3 药物敏感性结果Tab.3 Results of mcrobial sensitivity test

表4 沙门菌多重耐药结果Tab.4 Multiple drug resistance results

3 讨 论

本次研究显示生熟肉制品、动物粪便、水产品及厨房用具中均有沙门菌的存在,从生鸡肉和生猪肉中菌株的检出率较高,其次是鸡粪和猪粪.分离菌株的血清型分布非常广泛,而且不同的宿主血清型的分布特征也有很大的差异.此次研究环境中所分离出的332株沙门菌可分为39种血清型,表明河南省环境中沙门菌血清型分布具有多样性.位于第1位的血清型是肠炎沙门菌,其次是德尔卑沙门菌和鼠伤寒沙门菌,这与临床流行病学调查基本相符[3],但与河南省腹泻病人及生肉食品中分离的前5位沙门菌血清型略有不符[4-5].德尔卑沙门菌、鼠伤寒沙门菌和阿贡纳沙门菌是从猪肉来源分离出来的沙门菌最常见血清型;而肠炎沙门菌、印第安纳沙门菌和德尔卑沙门菌是鸡肉中分离出沙门菌的主要血清型.这和孙吉昌[6]、王勤[7]等的研究有一定的区别,这说明即使食品种类相同,但畜禽的生长环境和地域不同,其携带或污染的沙门菌血清型之间也存在差异,也说明沙门菌的血清型分布有一定的地域特点.通过对宿主分析发现,肠炎沙门菌绝大多数来自于鸡宿主源(鸡酮体、鸡内脏、鸡粪等),而德尔卑沙门菌大多数来自于猪宿主源(猪肉和猪粪),结合国内其它研究数据[8-10],可以看出肠炎沙门菌是污染家禽产品的优势血清型,而德尔卑沙门菌是生猪养殖及屠宰环节中的优势血清型,说明了广泛流行于畜禽中沙门菌的血清型种类具有一定程度的一致性,也表明肉类食品沙门菌的污染与养殖场的卫生状况有很大的关联.

由于抗生素在临床和畜牧业中的广泛使用,细菌耐药是近年来医疗卫生机构面临的重大问题.对环境中沙门菌耐药性的研究发现其对临床治疗沙门菌感染的传统药物氯霉素、广谱青霉素、磺胺类和四环素类抗生素均产生了一定的耐药性,对第三代头孢类和三代喹诺酮类抗生素敏感性较强;这可能与畜牧业中抗生素的不规范使用有关,如将抗生素作为饲料添加剂以预防动物疾病和促进生长而长期使用,使得抗生素以原形或代谢物形式由畜禽的粪尿排入环境,从而导致沙门菌对氯霉素、广谱青霉素、磺胺类和四环素类抗生素的较高耐受.在临床上三代头孢类药物主要用于儿童沙门菌感染患者,而氟喹诺酮类药物是用于治疗成人沙门菌感染[11].本次结果显示,外环境中沙门菌对头孢吡肟和头孢他啶十分敏感,但对环丙沙星和诺氟沙星出现耐药现象,这与陈盛杰[12]等的研究结果一致,表明随其在临床及畜牧业的广泛持续使用,也产生一定的耐药性,甚至多重耐药.对此应继续增强对沙门菌污染的主动监测力度,加强对环境中沙门菌的分布研究,从而减少食物受沙门菌污染而引起的感染性疾病,并为畜牧养殖业抗生素的合理使用提供数据指导.