帕金森病模型大鼠脑组织SPTLC2的表达研究

何晓燕　焦燕　李红燕

[摘要] 目的 探究絲氨酸棕榈酰转移酶长链亚基2（SPTLC2）在帕金森病大鼠脑组织中的表达。 方法 采用注射6-羟基多巴胺制备帕金森病大鼠模型，将模型组分为三组：模型组（2周）、模型组（4周）、模型组（8周），同时设置正常组，采用异常不自主动作（AIM）评分法评定各组大鼠行为，同时记录旋转持续时间、启动时间、剂峰旋转圈数。HE染色法观察大鼠脑组织变化，免疫组化法检测大鼠脑组织中α突触核蛋白的表达，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法测定大鼠脑组织中SPTLC2 mRNA表达，Western blot检测大鼠脑组织中SPTLC2蛋白表达。 结果 模型组大鼠AIM评分、旋转持续时间、启动时间、剂峰旋转圈数均高于正常组，随着时间的延长，AIM评分、旋转启动时间、剂峰旋转圈数逐渐升高，旋转启动时间逐渐降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。免疫组化染色显示，正常组α突触核蛋白阳性细胞数量较少，模型组阳性细胞数量明显增多，且随着时间的延长，阳性细胞数量逐渐升高。与正常组、模型组（2周）相比，模型组（4周）、模型组（8周）SPTLC2基因、蛋白表达量均升高；与模型组（4周）相比，模型组（8周）SPTLC2基因、蛋白表达量升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 SPTLC2可能参与帕金森病疾病的发生，通过上调SPTLC2基因、蛋白水平的表达来实现。

[关键词] 帕金森病；丝氨酸棕榈酰转移酶长链亚基2；脑组织；模型

[中图分类号] R742.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（a）-0021-04

Study on SPTLC2 expression level in brain tissue in the rat model of Parkinson disease

HE Xiaoyan JIAO Yan LI Hongyan

Department of Neurology， People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830001， China

[Abstract] Objective To explore the expression of serine palmitate transferase long chain subunit 2 （SPTLC2） in brain tissue in the rat model of Parkinson disease. Methods Parkinson rat model was prepared by injecting 6-hydroxy dopamine， and the rats were divided into three groups， 2-week model group， 4-week model group， 8-week model group， and normal group. Behaviors of rats in each group were assessed by using abnormal involuntary movement （AIM） scoring method. Rotation duration， starting time， the cycle number of agent peak were recorded meanwhile. HE staining method was used to observe the changes of brain tissue in rats， and the expression of α synuclein in rat brain tissue was detected by immunohistochemistry， and SPTLC2 and mRNA expression in brain tissue of rats was detected by using RT-PCR， and SPTLC2 protein expression in rat brain tissue was detected by Western blot. Results AIM score， rotation duration， starting time， agent peak rotation number in model group was higher than those in the normal group， and with the extension of time， AIM score， rotating start time， agent peak rotation number gradually increased， while the rotation starting time gradually decreased， with statistically significant differences （P < 0.05）. Immunohistochemical staining showed that the number of positive cells in the normal group was less than that in the normal group， and the number of positive cells in the model group increased significantly. The number of positive cells increased gradually with the extension of time. Compared with those in the normal group and 2-week model group， SPTLC2 gene and protein expression in 4-week and 8-week model group increased， and compared with 4-week model group， SPTLC2 gene and protein expression in 8-week model group increased， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion SPTLC2 may be involved in the pathogenesis of Parkinson disease， via up-regulating SPTLC2 gene and protein expression.

[Key words] Parkinson disease； Serine palmitate transferase long chain subunit 2； Brain tissue； Model

帕金森病属于临床神经系统疾病，调查显示在我国发病率为1%～2%，近年来发病率逐年上升，患者认知、精神、行为、感觉出现障碍，给家庭社会造成巨大负担，因此对帕金森病的研究十分必要[1]。最近研究显示，丝氨酸棕榈酰转移酶长链亚基2（serine palmitoy ltransferase long chain base subunit 2，SPTLC2）在神经病变调控中发挥着重要作用，SPTLC2基因发生突变后导致轴突神经病变，丧失感觉[2]，以往对帕金森病病变机制探究较多[3]，但鲜见对其与SPTLC2基因间的关系进行探究。本研究通过制备帕金森病大鼠模型，采用不同生物学方法检测脑组织中SPTLC2水平，旨在探究SPTLC2是否参与帕金森病发病过程。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SD大鼠26只（北京生命科学研究所，许可证号：SYXK2016-0012），均为SPF级动物，雄性。所有动物均在统一环境中进行饲养，温度控制在（23±2）℃，湿度65%，自动光照控制（7：00～19：00照明），饲养时严格按照动物管理规则执行。

1.2 试剂与仪器

水合氯醛（北京百奥莱博科技有限公司，批号：305-17-6）；6-羟基多巴胺购自于美国Sigma公司，批号：162843；SYBR PCR Master Mix购自于日本Takara公司，批号：170219；兔抗大鼠α-synuclein蛋白、SPTLC2单克隆抗体一抗、HRP标记山羊抗兔二抗购自于美国Santa cruz公司，批号：161106、170826、170524；RNA提取试剂盒购自于北京生化科技有限公司，批号：213506；反转录试剂盒购自于日本Takara公司批號：170523；BCA测定试剂盒购自于上海碧云天生物科技有限公司，批号：170628；PVDF膜购自于美国Millpore公司批号：171021；380R高速冷冻离心机购自于德国Hettich公司；光学显微镜购自于上海光学仪器厂；荧光定量PCR仪购自于美国BioRed公司。

1.3 方法

1.3.1 帕金森病大鼠模型制备 取20只大鼠进行模型制备采用10%水合氯醛进行腹腔麻醉，将大鼠固定于定位仪上，进行头部去毛，常规消毒，切开颅骨皮肤，剥离骨膜，使前囟暴露，用颅骨钻钻开颅骨，将6-羟基多巴胺用微量注射器注入黑质部，注射速率为1 mm/min，注射结束后医用海绵填塞颅骨孔，缝合切口。

1.3.2 大鼠行为评定 采用异常不自主动作（abnormal involuntary movement，AIM）[4]评分法进行评定，设计前肢、口面部、轴性及运动4部分，根据情况严重程度分为5个等级：无，0分；偶尔出现，1分；经常出现，2分；持续存在，刺激后可停止，3分；持续存在，刺激后也无法停止，4分。同时记录旋转持续时间、启动时间、剂峰旋转圈数。

1.3.3 HE染色 分别于2、4、8周取6只大鼠处死后，取脑组织放入4%多聚甲醛中进行固定，常规制备石蜡切片，在70℃烤片机上加热10 min，在二甲苯中进行2次脱蜡，每次10 min，在100%、95%、80%乙醇中分别脱水5 min，蒸馏水、磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，加入苏木精进行染色10 min，浸入1%盐酸后用蒸馏水进行冲洗。加入伊红染液均染色3 min，依次在75%、85%、95%、100%中脱水2 min，加入二甲苯进行透明处理，滴加中性树脂进行封片，将切片放置显微镜下进行观察。

1.3.4 免疫组化法检测大鼠脑组织中α突触核蛋白的表达 将制备好的石蜡切片置于3%双氧水-甲醇溶液中10 min，PBE溶液漂洗3次，95℃加热10 min，蒸馏水冲洗后晾干，滴加α-突触核蛋白一抗，置于4℃冰箱中过夜孵育，PBS清洗后晾干，加入HRP标记链霉素乱掰素溶液，室温下孵育10 min，PBS漂洗后，滴加50 μL DAB显色鲜室温下染色2 min，蒸馏水冲洗后加入苏木精复染，自来水冲洗后加入0.1%盐水酒精溶液中浸泡1 min，在75%、85%、95%、100%梯度酒精中脱水2 min，加入二甲苯进行透明处理，滴加中性树脂进行封片，将切片放置显微镜下进行观察。

1.3.5 RT-PCR法测定大鼠脑组织中SPTLC2 mRNA表达 将脑组织在PBS缓冲液中清洗后用无菌剪刀剪碎后，提取组织总RNA并反转录为cDNA，RT-PCR引物由广州Invitrogen公司合成。SPTLC2序列，F：GT？鄄ACGCCACGTCAATGTCAC；R：CAGCATCTCTCTCCC？鄄AAAGG。GAPDH序列，F：CTCATGACCACAGTCCAT？鄄GC；R：TTCAGCTCTGGGATGACCTT。反应体系：2×SYBR Mix10 μL；1cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，H2O 8 μL。在PCR仪上设置95℃ 2 min、95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min，35个循环，72℃延伸10 min。反应后在CFX manager 3.0软件进行数据分析，以GADPH作为内参基因按照2-ΔΔCt算法进行基因相对定量表达分析。

1.3.6 Western blot检测大鼠脑组织中SPTLC2蛋白表达 将脑组织剪碎后加入蛋白裂解液在冰上反应30 min，3000 r/min离心10 min收集上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，制备8%分离胶、12.5%浓缩胶，蛋白上样量统一为30 μg，当样品进浓缩胶后电压设置为80 V，进入分离胶后，电压调整为120 V，电泳结束后转移蛋白凝胶至PVDF膜上，转膜反应在冰上进行，电压设置为100 V，反应时间为1 h，加入TBST溶液进行清洗后，加入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，TBST溶液清洗PVDF膜，加入一抗稀释液（SPTLC2），4℃震荡过夜，加入PBST溶液清洗3次，每次10 min，加入二抗稀释液，室温下孵育2 h，PBST清洗后在凝胶成像仪中观察蛋白表达情况。

1.4 统计学方法

应用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间对比采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠行为评定结果

模型组大鼠AIM评分、旋转持续时间、启动时间、剂峰旋转圈数均高于正常组，随着时间的延长，AIM评分、旋转启动时间、剂峰旋转圈数逐渐升高，旋转启动时间逐渐降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 大鼠脑组织HE染色及α突触核蛋白的表达

脑组织HE染色显示正常组大鼠神经元细胞染色呈椭圆形、圆形，细胞核染色较均匀呈蓝紫色数量较多，模型组神经元细胞较小，颜色较浅，数量有所降低，随着时间的延长，神经元细胞数量逐渐降低，模型组2周神经元细胞与正常组相比并无明显差异。免疫组化染色显示阳性细胞染色呈棕褐色，大部分细胞位于细胞核中，正常组阳性细胞数量较少，模型组阳性细胞数量明显增多，且随着时间的延长，阳性细胞数量逐渐升高。见图1（封三）。

2.3 脑组织中SPTLC2基因、蛋白表达

与正常组、模型组（2周）比较，模型组（4周）、模型组（8周）SPTLC2基因、蛋白表达量均升高，与模型组（4周）比较，模型组（8周）SPTLC2基因、蛋白表达量升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。正常组与模型组（2周）比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

3 讨论

目前学者对帕金森病病变机制的研究主要包括以下几方面：①机体内活性氧集团数量过多产生氧化应激反应，损伤细胞导致细胞死亡，且脑组织对此反应更敏感；②居住环境中存在较多工业化学物质能够毒害神经，使神经元死亡；③线粒体功能异常，使机体细胞内能量生成出現障碍以及自由基水平升高，导致神经细胞凋亡；④随着年龄增长，神经系统老化，多巴胺脱梭酶以及酪氨酸羟化酶活力较弱，神经元出现退变；⑤具有家族遗传史，可能为显性遗传病变[5-6]。

本研究参考国外相关文献制备帕金森病大鼠模型[7]，采用单点法注射6-羟基多巴胺注射后。有关研究表明，在制备模型后，脑组织中黑质内神经元会逐渐发生凋亡，神经元数量降低，突触后膜多巴胺受体敏感性增强，导致损伤侧多巴胺受体过度兴奋动物会产生偏向健侧的旋转[8]。本研究结果显示，与正常组相比，模型组大鼠AIM评分、旋转持续时间、启动时间、剂峰旋转圈数均高于正常组，表明在注射6-羟基多巴胺后能够影响动物行为变化，发生旋转。本研究还发现，随着时间的延长，旋转圈数也逐渐增加，与2、4周相比具有明显的差异性，表明随着时间的延长，大鼠脑部受伤越严重，这与国外相关研究相符[9]。

α突触核蛋白由酸性氨基酸组成，亲水性较高，在黑质、海马、皮质等与记忆相关区域均表达，参与神经元的发育以及神经退变。国外报道显示α突触核蛋白能够与多巴胺转运体结合形成蛋白复合体，参与调控多巴胺的合成，机体内α突触核蛋白由异常增多导致其调控功能降低，进而使突触中多巴胺水平升高，使氧化应激反应增强，细胞毒性增强[10]。有学者研究显示，α突触核蛋白在神经细胞胞浆中常与tau蛋白结合形成神经纤维缠结淀粉样斑块，染色后可出现棕黑色沉淀[11]。本研究大鼠脑组织HE染色显示，正常组大鼠神经元细胞染色呈椭圆形、圆形，细胞核染色较均匀呈蓝紫色数量较多，模型组神经元细胞较小，颜色较浅，数量有所降低，随着时间的延长，神经元细胞数量逐渐降低，提示帕金森病模型大鼠脑部受损后能够导致神经元数量降低，免疫组化染色显示，正常组α突触核蛋白阳性数量较少，模型组阳性数量明显增多，且随着时间的延长，阳性细胞数量逐渐升高，提示帕金森病动物模型随着时间的延长，α突触核蛋白表达量升高，脑部受损严重导致病情加重。

SPT是神经酰胺从头合成关键酶，SPTLC2属于其中一个亚基，在神经细胞的诱导凋亡中发挥重要作用[12]。相关学者研究显示SPTLC2杂合子小鼠中，鞘磷脂、神经酰胺的合成能力增加，细胞膜信号转导作用增强，血清中脂蛋白水平升高，促进动脉粥样硬化的发展[13]。还有研究显示SPTLC2基因突变后能够引发周围神经突变，导致神经感觉丧失，如引发自主神经病变Ⅰ型[14]。国外学者研究显示SPTLC2基因缺失型小鼠神经酰胺以及鞘磷脂含量明显降低，胰岛素敏感性增强，能够有效抑制肥胖以及胰岛素抵抗[15]。国内相关文献研究显示，通过过表达SPTLC2基因，能够提高神经酰胺含量，促进细胞自噬、凋亡[16]。本研究通过不同检测方法显示，与正常组、模型组（2周）相比，模型组（4周）、模型组（8周）SPTLC2基因、蛋白表达量均升高，且随着时间的延长，含量逐渐上升，表明SPTLC2基因、蛋白含量升高，能够引起帕金森病大鼠疾病的加重，提示其可能参与神经病变的调控，但具体的机制还有待后续研究。

本研究也存在一定的局限性，注射的6-羟基多巴胺浓度梯度选取较少，后期需要设置不同梯度的6-羟基多巴胺进行进一步验证，此外并未对SPTLC2基因影响神经病变的机制进行深入研究，仅比较表达水平的差异，后期还需深入探究。总之，SPTLC2可能参与帕金森病疾病的发生，并通过上调SPTLC2基因、蛋白水平的表达来实现。

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（收稿日期：2017-10-07 本文编辑：张瑜杰）