长链非编码RNAH19在甲状腺癌中的表达及预后预测的研究

刘娜　乞艳华　周琦

[摘要] 目的 探討长链非编码RNA H19（lncRNA H19）在甲状腺癌中的表达情况及其与临床病理特征和预后的相关性，寻找影响甲状腺癌治疗及预后的新靶点。 方法 选取2009年1月～2012年1月从西安交大第二附属医院搜集的131例甲状腺癌组织和癌旁组织为病例组，另外同期选取122例甲状腺良性肿瘤组织作为对照组。采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测lncRNA H19的表达情况。之后进行5年跟踪随访。通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估lncRNA H19对甲状腺癌的诊断价值。应用Kaplan-Meier方法计算5年累积生存率，预后相关单因素分析采用Log-rank检验，多因素分析采用Cox回归模型。 结果 与甲状腺良性肿瘤组织及癌旁组织比较，甲状腺癌组织中lncRNA H19表达升高（P < 0.05）。lncRNA H19诊断甲状腺癌ROC曲线下面积（AUC）为0.801，诊断阈值3.58，敏感度和特异度分别为72.5%和75.4%，约登指数0.479。肿瘤直径≥1 cm、TNM Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴结转移的甲状腺癌组织中lnc RNA H19表达水平明显高于肿瘤直径<1 cm、TNM Ⅰ+Ⅱ期及无淋巴结转移的甲状腺癌组织，差异均有统计学意义（P < 0.05）。lncRNA H19高表达者5年生存率下降（28.44%）。lncRNA H19表达水平、肿瘤直径、TNM分期和淋巴结转移是影响甲状腺癌预后的独立风险因素。 结论 lncRNA H19在甲状腺癌组织中高表达，lncRNA H19表达水平上调与甲状腺癌预后差相关，提示其可能是甲状腺癌发生发展的分子调节机制之一，并可为甲状腺癌早期无创诊断及治疗靶点的寻找提供重要理论依据。

[关键词] 甲状腺癌；长链非编码RNAs；长链非编码RNA H19；预后

[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（a）-0025-06

Expression status and prognostic significance of lncRNA H19 in thyroid carcinoma

LIU Na1 QI Yanhua1 ZHOU Qi1 CHENG Chuantao2 YANG Wenbin2

1.Department of Ultrasound， the Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiao Tong University， Shaanxi Province， Xi′an 710004， China； 2.Department of General Surgery， the Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiao Tong University， Shaanxi Province， Xi′an 710004， China

[Abstract] Objective To explore the expression of long non-coding RNA H19 （lncRNA H19） in thyroid carcinoma （TC）， and its correlation with the clinicopathologic characteristics and prognosis of TC. Methods From January 2009 to January 2012， 131 TC tissues and adjacent tissues were collected from patients after thyroid surgery between as case group. Concurrently， additional 122 normal thyroid tissues from patients with benign thyroid lesions were obtained as normal control group. The expression level of lncRNA H19 were detected by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. five years follow-ups were conducted. Receiver operating curve（ROC） was used to evaluate the diagnostic values of lncRNA H19 for TC. The Kaplan-Meier method were employed to analyze 5-year survival rate of TC patient. Both univariate and multivariate analyses were performed to analyze the prognostic factors of TC. Results The lncRNA H19 expression was higher in TC tissues than that in the adjacent and normal tissues（P < 0.05）. The area under the ROC curve（AUC） of lncRNA H19 were 0.801. Diagnostic boundary point was 3.58. Sensitivity and specificity was 72.5% and 75.4% respectively. Youden index was 0.479. The lncRNA H19 expression in TC tissue with tumor diameter no less than 1 cm， TNM Ⅲ+Ⅳ stage， or lymph node metastasis was evidently higher than that in TC tissue with tumor smaller than 1 cm， TNM Ⅰ+Ⅱ stage， or without lymph node metastasis（P < 0.05）. The 5-year survival rate of TC patients with high lncRNA H19 expression declined （28.44%）. The expression of lncRNA H19， tumor diameter， TNM stage and lymph node metastasis were independent prognostic factors of TC patients （P < 0.05）. Conclusion The increased lncRNA H19 expression levels are associated with clinicopathologic characteristics and poor prognosis in TC patients. And it may be one of the molecular regulation mechanism in TC occurrence and development. This study also can provide basis for noninvasive diagnosis and therapeutic target searching in TC.

[Key words] Thyroid carcinoma； Long non-coding RNAs； lncRNA H19； Prognosis

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，且30年来，发病率逐渐增高，目前统计我国甲状腺癌的发病率和病死率分别为0.32%和0.03%[1]。甲状腺乳头状癌是主要的病理类型，占所有甲状腺恶性肿瘤的86%[2]。甲状腺癌根治术是目前治疗甲状腺癌的主要方式，虽然绝大多数患者手术切除后有很好的总体生存率，但也有部分患者手术治疗后预后差。甲状腺癌的侵袭特征、发生机制尚不明确，分子调控机制是一个新的思路。一个理想的生物标志物有助于早期诊断甲状腺癌，判断其预后情况。lncRNAs（long non-coding RNAs）一般是指大于200个核苷酸，缺少为蛋白质编码功能的RNA[3]。已有证据表明lncRNAs与多种恶性肿瘤的发生、迁移、凋亡过程相关[4]。lncRNA H19在人胚胎组织，骨骼肌肉组织大量表达，其调节通路与许多肿瘤如胃肠道肿瘤、结肠肿瘤和膀胱肿瘤的基因凋亡有关[5]。另外，长链非编码RNA相对于短链和中链非编码RNA的研究历史更长，数据库较全[6]。但是，关于lncRNAs和它在甲状腺癌发生发展过程中所扮演的角色鲜有报道。因此，探索lncRNA H19与甲状腺癌预后的相关性，期望发现一种新的甲状腺癌早期诊断和预后判断的方法，是本文的宗旨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2009年1月～2012年1月，收集在西安交通大学第二附属医院（以下简称“我院”）行甲状腺癌根治术的131例甲状腺癌组织和癌旁组织（距甲状腺癌组织3～5 cm。同期，收集122例行甲状腺部分切除术的甲状腺良性疾病的甲状腺组织作为对照组。所有组织标本用10%甲醛固定并石蜡包埋，切面厚度4 μm备用。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署使用其组织样本知情同意书。纳入标准：①患者除了病理诊断为甲状腺癌，其他器官没有严重疾病。②患者尚未进行甲状腺癌术后为期3周的放射治疗。③患者术前甲功正常；④患者无其他恶性肿瘤病史或放射线暴露史。排除标准：患者有远处转移或肺转移（包括合并其他肿瘤或原发性肺癌）。②患者有精神疾患或情绪不稳定无法配合。③患者有慢性疾病如心肌梗死、脑卒中、心力衰竭和心房纤颤。④患者术前甲功不正常。⑤患者有其他恶性肿瘤病史或放射线暴露史。

病例组中，男43例，女88例；年龄15～78岁，平均（45.3±8.2）岁。对照组中，男38例，女84例；年龄20～74岁，平均（47.1±8.7）岁。两组年龄和性别比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。病例组中，87例肿瘤直径≥1.0 cm，44例肿瘤直径< 1.0 cm；甲状腺癌术后病理分型中，76例为甲状腺乳头状癌，29例滤泡癌，26例髓样癌；52例肿瘤突破包膜，79例肿瘤未突破包膜；根据2002年UICC指南中甲状腺癌TNM分期[7]，51例TNM Ⅰ+Ⅱ期，80例TNM Ⅲ+Ⅳ期；69例有淋巴结转移，62例没有淋巴结转移。

1.2 實时定量聚合酶链反应

采用TRIzol法提取病例组与对照组样本组织RNA。按照TAKARA试剂盒说明反转录第一个单链DNA（TAKARA，宝生物工程大连有限公司），合成出的cDNA作为模板用于扩增H19和GAPDH（内参基因）。PCR反应体系（20 μL）组成包括7.8 μL的双蒸馏水，1.0 μL DNA模板，各0.4 μL上游和下游引物，0.4 μL ROX参考染料（50×），10.0 μL SYBR。反应流程：95℃条件下，预变性2 min，接着40个循环，95℃，5 s；冷却到60℃，34 s，延伸到68℃，30 s；取各个样本的cDNA及其相对应的引物（表1）按照以上方法混合，然后进行PCR扩增，收集荧光信号，进行熔接曲线分析，反应结束后由系统自动计算相对定量的结果，每个样本重复3次。

1.3 随访观察

对患者的随访主要通过门诊复查、电话及电子邮件的方式，一般在术后第1个月进行1次，第1年每3个月随访1次，第2年每6个月随访1次，以后每1年随访1次，一直随访至2017年1月31日结束。随访率达到100%，所有患者相关的临床数据都被随访记录了5年。

1.4 数据分析

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验和Fisher's 精确概率检验；ROC曲线评价lncRNA H19对甲状腺癌的诊断价值；Kaplan-Meier生存曲线法及Log-Rank检验分析不同lncRNAH19表达程度患者5年总体生存期的差异；COX比例风险回归模型分析lncRNAH19表达及临床病理特征对总体生存期的影响，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lnc RNA H19在甲状腺癌组织、癌旁组织及正常甲状腺组织中的表达情况

qRT-PCR结果显示，lnc RNA H19在甲状腺癌组织、癌旁组织及正常甲状腺组织中表达分别为（4.02±0.85）、（3.24±0.73）和（3.07±0.81）。与癌旁组织及正常甲状腺组织比较，lnc RNA H19在甲状腺癌组织中表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。lnc RNA H19在癌旁组织和正常甲状腺组织中表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.2 ROC曲线评价lnc RNA H19对甲状腺癌的诊断价值

lnc RNA H19表达诊断甲状腺癌 ROC曲线下面积0.801（P < 0.001；95%CI：0.747～0.855），诊断阈值3.58，敏感度和特异度分别为72.5%和75.4%，约登指数0.479。提示当lncRNA H19表达水平≥3.58时，甲状腺癌发生机会增加。见图2。

2.3 lnc RNA H19表达水平与甲状腺癌不同临床病理特征的关系

根据约登指数，选取灵敏度和特异度之和的最高点为截断值，lnc RNA H19 诊断界点为3.58，≥3.58表示H19高表达，<3.58表示H19低表达。结果显示，肿瘤直径≥1 cm、TNM Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴结转移的甲状腺癌组织中lnc RNA H19表达水平明显高于肿瘤直径<1 cm、TNM Ⅰ+Ⅱ期及无淋巴结转移的甲状腺癌组织，差异均有统计学意义（P < 0.05）。lnc RNA H19的表达水平在不同性别、年龄、组织病理分型及包膜浸润的甲状腺癌组织中差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.4 lnc RNA H19表达与甲状腺癌预后的相关性

术后随访5年的131例患者中，53例患者存活，78例患者死亡，死亡率为59.5%。131例患者术后病理证实，22%周围组织侵犯，10%远处转移，6%对侧甲状腺转移，40%颈部淋巴结转移。远处转移的病例中，8例肺转移，1例肝转移，4例骨转移，1例肾上腺转移。其中乳头状癌死亡41例，髓样癌死亡18例，滤泡状癌死亡19例。其中64例死于该肿瘤，14例死于远处转移。Kaplan-Meier生存分析曲线显示，lncRNA H19高表达者5年生存率为28.44%（27/95），低表达者5年生存率为72.2%（26/36）。见图3。

2.5 单因素分析影响甲状腺癌预后因素

预后相关单因素分析采用Log-rank检验，结果显示肿瘤直径≥1.0 cm，高的TNM分期和有淋巴结转移时，平均生存率降低（P < 0.05）。总体生存率与性别、年龄、组织病理分型、有无包膜浸润等临床病理特征无明显相关性（P > 0.05）。见表3。

2.6 多因素分析影响甲状腺癌预后因素

采用COX比例风险回归模型，分析lnc RNA H19表达程度、年龄、性别、肿瘤直径、组织病理分型、有无包膜浸润、TNM分期和淋巴结转移与甲状腺癌预后的关系。结果显示lnc RNA H19表达，肿瘤直径，TNM分期和淋巴结转移是影响甲状腺癌预后的独立危险因素（P < 0.05）。年龄、性别、组织病理分型、有无包膜浸润与甲状腺癌预后无关（P > 0.05）。表见4。

3 讨论

发现控制肿瘤生长、侵袭和转移机制对肿瘤发生和肿瘤治疗至关重要。本研究旨在探索lnc RNA H19表达与甲状腺癌不同临床病理特征的关系，及对甲状腺癌预后影响，探索其机制，以提供更好的早期诊断和治疗方式。

首先，本研究结果显示lnc RNA H19在甲状腺癌组织中表达较高。lnc RNA已被证实参与多种肿瘤发生[8]，lncRNAs失调影响表观遗传信息，发挥细胞生长优势，促进恶性肿瘤生长[9]。其中lnc RNA H19是典型的例子，但它在甲状腺癌发生发展中所扮演的角色鲜有报道。H19基因位于人染色体11p15，可转录成大小约2.3 kb的长链非编码RNA，即lnc RNA H19参与基因表达的调控过程[10]，转录的H19保守印记基因簇也转录编码胰岛素样生长因子2（IGF2），H19-IGF2基因对胚胎发育和生长控制有重要的作用，H19抑制胚胎胎盘生长，在胚胎发育过程中调节印记基因[11]。然而它在肿瘤发生发展中的角色，是致癌基因还是抑癌基因，依赖于肿瘤分型和细胞内成分[12]。

其次，本研究证实lnc RNA H19表达上调者与低表达者比较，甲状腺癌5年生存率减低，除此之外，肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移等也被证实是影响甲状腺癌预后的独立危险因素。有证据显示H19在不同恶性肿瘤多种病理状态下呈现高表达[13]，其表达上调表明了他的致癌属性的可能性[14]。Wang等[15]发现了H19在膀胱癌组织中高表达，揭示了H19表达与肿瘤尺寸及淋巴结转移相关，体外实验证实H19能够促进癌细胞增殖，H19表达情况在膀胱癌组织中高于其旁非肿瘤组织[16]。更进一步证实了H19在胃癌组织有高表达率，且与TNM分期和淋巴结转移都是影响胃癌预后的独立风险因素[17]。还有研究者通过体外实验促进生长和转移发现H19促进乳腺癌肿瘤细胞侵袭性。Raveh等[18]研究发现H19在上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过程中起着关键作用，并证实H19在人类恶性肿瘤中有促进转移的功能。p53是抑癌基因，能够抑制肿瘤生长和转移。p53基因突变是人类恶性肿瘤最常见的基因改变[19]，进一步讨论H19与p53的关系，他们的关联可导致P53失活，另外在膀胱癌中，H19可正向调控microrna-675（miR-675）表达，抑制P53基因活化。研究者也进一步强调H19与miR-675在胃癌发展过程中的交互作用，指出H19在在所有乳腺癌细胞系中能够减少泛素蛋白链接酶E3家族（c-Cbl和Cbl-b）的表达[20]。提示lncRNA H19在预测肿瘤转移方面有很好的预后判断价值。

综上所述，本研究提示，与良性甲状腺组织和癌旁组织比较，甲状腺组织中lncRNA H19的表達水平明显增高，且lncRNA H19高表达的患者总体生存期变短。lncRNA H19表达是影响甲状腺癌预后的独立风险因素。这些结果表明lncRNA H19可能在甲状腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。但由于受样本量限制，其与甲状腺癌患者的临床病理特征的相关性尚不明确，因此，对未来进一步研究的期望，尚需要扩大样本量进一步研究论证，细化肿瘤分期，继续进行深入讨论关于甲状腺癌不同临床病理特征的相关性的实验。并对lncRNAH19表达情况做更进一步远期生存率的观察。研究lncRNAH19在甲状腺癌发生发展所扮演的角色，期望发现一种新的甲状腺癌早期诊断和预后判断的方法。

[参考文献]

[1] La VC，Malvezzi M，Bosetti C，et al. Thyroid cancer mortality and incidence： a global overview [J]. INT J Cancer，2015，136（9）：2187-2195.

[2] Deirdre K，Catherine MK. Clinical overview of thyroid cancer and recent advances in treatment [J]. J Oncol Med & Pract，2016，1（2）：1-6.

[3] Chen T，Yang P，He ZY. Long noncoding RNA H19 can predict a poor prognosis and lymph node metastasis：a meta-analysis in human cancer [J]. Minerva Medica，2016， 107（4）：251-258.

[4] Liz J，Esteller M. LncRNAs and microRNAs with a role in cancer development [J]. Biochimica Et Biophysica Acta，2016，1859（1）：169-177.

[5] 赵青芳，关露露，陈小兵.长链非编码RNA在胃癌中作用机制的研究进展[J].中国医药导报，2017，14（8）：33-36.

[6] 张明娇，吴勇，李珉珉.长链非编码RNAs的生物功能及其与器官发育和恶性肿瘤的关系[J].中国病理生理杂志，2015，31（11）：2107-2112.

[7] Kim M，Kim WG，Oh HS，et al. Comparison of the seventh and eighth editions of the American Joint Committee on Cancer/Union for international cancer control Tumor-Node-Metastasis Staging System for differentiated thyroid cancer [J]. Thyroid，2017，27（9）：1149-1155.

[8] 魏晨晨，王朝霞.长链非编码RNA H19在肿瘤研究中的进展[J].临床肿瘤学杂志，2015，20（11）：1041-1044.

[9] Liz J，Esteller M. lncRNAs and microRNAs with a role in cancer development [J]. Biochimica Et Biophysica Acta，2016，1859（1）：169-177.

[10] Zhang T，Wang Y R，Zeng F，et al. LncRNA H19 is overexpressed in glioma tissue，is negatively associated with patient survival，and promotes tumor growth through its derivative miR-675 [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016， 56 20（23）：4891-4897.

[11] 许敏，吕述彦.印记基因与胎儿生长发育关系的研究进展[J].山东医药，2016，（1）：102-104.

[12] Zhang DM，Lin ZY，Yang ZH，et al. LncRNA H19 promotes tongue squamous cell carcinoma progression through β-catenin/GSK3β/EMT signaling via association with EZH2 [J]. Am J Transl Res，2017，9（7）：3474-3486.

[13] Wang SH，Wu XC，Zhang MD，et al. Upregulation of H19 indicates a poor prognosis in gallbladder carcinoma and promotes epithelial-mesenchymal transition [J]. AM J Cancer Res，2016，6（4）：15-26.

[14] Looijenga LH，Verkerk AJ，De GN，et al. H19 in normal development and neoplasia [J]. Mol Reprod Dev，2015， 46（3）：419-439.

[15] Wang H，Men CP. Correlation of Increased Expression of MicroRNA-155 in Bladder Cancer and Prognosis [J]. Lab Med，2015，46（2）：118-122.

[16] Hua Q，Lv X，Gu X，et al. Genetic variants in lncRNA H19 are associated with the risk of bladder cancer in a Chinese population [J]. Mutagenesis，2016，31（5）：531-538.

[17] Chen JS，Wang YF，Zhang XQ，et al. H19 serves as a diagnostic biomarker and up-regulation of H19 expression contributes to poor prognosis in patients with gastric cancer [J]. Neoplasma，2016，63（2）：223-230.

[18] Raveh E，Matouk IJ，Gilon M，et al. The H19 Long non-coding RNA in cancer initiation，progression and metastasis-a proposed unifying theory [J]. Mol Cancer，2015， 14（1）：184-198.

[19] Liu C，Chen Z，Fang J，et al. H19-derived miR-675 contributes to bladder cancer cell proliferation by regulating p53 activation：[J]. Tumor Biol，2016，37（1）：263-270.

[20] Zhang K，Luo Z，Zhang Y，et al. Circulating lncRNA H19 in plasma as a novel biomarker for breast cancer [J]. Cancer Biomark，2016，17（2）：187-194.

（收稿日期：2018-01-18 本文編辑：任 念）