非清髓预处理及人脐带血造血干细胞移植对小鼠生精功能的影响

张萌　姚观平　何方

[摘要] 目的 探讨化疗药非清髓预处理与人脐带血造血干细胞移植（HSCT）对小鼠生精功能的影响。 方法 将30只Balb/c小鼠按照随机数字表法分為三组，每组10只，分别为对照组、白消安（BU）联合环磷酰胺（CY）非清髓预处理（BU+CY）组、HSCT组。除对照组外，BU+CY组和HSCT组使用BU 10 mg/kg和CY 120 mg/kg预处理造成睾丸损伤，HSCT组进行人脐带血HSCT。HSCT移植3周后，称重法计算睾丸指数，进行小鼠精液质量常规分析及睾丸、附睾的病理组织学检查。 结果 与对照组比较，BU+CY组小鼠睾丸指数、精子密度和精子活力均显著降低，而精子畸形率升高（P < 0.01）。HSCT组小鼠移植物抗宿主病（GVHD）评分较高，睾丸指数、精子密度和活力均高于BU+CY组（P < 0.05），精子畸形率低于BU+CY组（P < 0.01）。病理学检查发现，BU+CY组小鼠睾丸体积较小，生精小管破坏明显，生精细胞肿胀、排列紊乱，生精上皮变薄，生精小管与附睾管内精子数目大大减少；与BU+CY组比较，HSCT组睾丸体积增大，生精小管完整性较好，生精小管内精子数量较高，但生精上皮层数和精母细胞数量仍较少。 结论 BU+CY非清髓预处理可造成明显睾丸损伤，轻度急性GVHD情况下，脐带血HSCT可一定程度促进睾丸生精功能的恢复。

[关键词] 白消安；环磷酰胺；脐带血造血干细胞；睾丸损伤

[中图分类号] R737.21 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（a）-0009-05

The effects of non-myeloablative conditioning and cord blood hematopoietic stem cells transplantation on spermatogenic function in mice

ZHANG Meng1* YAO Guanping2* HE Fang1 LI Yuxiang3 FAN Zhenhai1 YU Limei1

1.Key Laboratory of Cell Engineering in Guizhou Province， Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Guizhou Province， Zunyi 563000， China； 2.Human Reproductive Medicine Center， Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Guizhou Province， Zunyi 563000， China； 3.Department of Phylaxiology and Pediatric Dentistry， Hospital of Stomatology， Zunyi Medical University， Guizhou Province， Zunyi 563000， China

[Abstract] Objective To explore the effects of chemotherapeutic drugs non-myeloablative pretreatment and human cord blood hematopoietic stem cells transplantation （HSCT） on the spermatogenic function in mice. Methods Thirty Balb/c mice were divided into 3 groups by random digital table method， with 10 mice in each group， which contained control group， Busulfan （BU） combined with Cyclophosphamide （CY） non-myeloablative conditioning （BU+CY） group and HSCT group. In addition to the control group， BU+CY group and HSCT group were pretreated with BU 10 mg/kg and CY 120 mg/kg to induce testicular lesion， and HSCT group was taken human umbilical cord blood HSCT. After HSCT for three weeks， the testicular index was calculated by weighting method. The routine quality analysis of semen and histopathological examination of the testis and epididymis were carried out. Results Compared with the control group， the testicular index， sperm density and sperm viability in BU+CY group were significantly decreased， but the sperm malformation rate was significantly increased （P < 0.01）. The graft versus host disease （GVHD） score was higher in HSCT group. The testicular index， sperm density and sperm viability in HSCT group were higher than those in BU+CY group （P < 0.05）， while the sperm malformation rate was lower than that of BU+CY group （P < 0.01）. The pathological examination found that the testicular volume in BU+CY group was smaller， the seminiferous tubules were obviously impaired， the spermatogenic cells were swelled and arranged in disorder， the seminiferous epithelia was thinned， the number of sperm was significantly reduced in seminiferous tubule and epididymal tubule. Compared with the BU+CY group， the testicular volume in HSCT group was increased， the seminiferous tubule was more integrity， and the number of sperm was increased， but the number of layers seminiferous epithelia cells and spermatocyte were still less. Conclusion BU+CY non-myeloablative conditioning can cause obvious testis injury. Cord blood HSCT can promote a certain extent recovery of testicular spermatogenesis in mild acute GVDH mice.

[Key words] Busulfan； Cyclophosphamide； Cord blood hematopoietic stem cell； Testis injury

不孕不育的夫妇中，男性因素约占50%，且有60%～65%的男性不育为特发性，其中大部分被认为是由遗传缺陷和表观遗传学异常所致[1]，也有相当一部分患者存在由药物和环境等因素所致病。白血病、再生障碍性贫血等疾病治疗中常用较大剂量白消安（Busulfan，BU）和环磷酰胺（Cyclophosphamide，CY）进行清髓或非清髓预处理，杀死大量肿瘤细胞，清除受者大量免疫细胞的同时，也会造成包括生殖器官在内的多种组织器官损伤[2]。单次腹腔注射较大剂量的CY或BU及二者联用也是建立非梗阻性无精症动物模型的常用方法[3]，一次性腹腔注射BU 10 mg/kg和CY 120 mg/kg，第4周小鼠出现睾丸生精小管内精子及精子细胞消失、睾丸指数下降，直至第12周产生间质纤维化和20周仍处于无精子状态[4]。非清髓处理后进行异基因脐带血造血干细胞移植（hematopoietic stem cells transplantation，HSCT），不但可明显促进骨髓造血免疫功能恢复，同时对大剂量化疗药物所致多组织器官的损伤具有促进再生修复的作用[2，5，6]，也有少数患者2年内恢复生育能力的报道，更多的研究认为HSCT受者睾丸生精功能及其精子质量会受到慢性移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）严重程度的影响，从而与受者不育症发生有关[7]，因此本研究在建立非清髓预处理致睾丸损伤的基础上，主要观察了脐带血HSCT后急性GVHD内对雄性小鼠生精功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 脐血标本 经产妇或家属知情同意，HBSAg、梅毒、HIV血清学检测阴性者，无菌采集足月剖宫产新生儿脐血，200 U/mL肝素抗凝，4 h内密度梯度离心分离人脐带血单个核细胞，流式检测脐带血CD34+造血干细胞含量0.4%～0.7%。

1.1.2 药物 BU（Sigma公司，美国）和CY（江苏恒瑞有限公司，0.2 g/瓶）均以生理盐水溶解，分别配制为1%和0.2%的储存液，冷冻保存备用。

1.1.3 动物 30只雄性Balb/c小鼠4～6周龄，体重18～22 g，购于解放军陆军军医大学，动物生产许可证号：SCXK（渝）2012-0005，动物批号：0000523。饲养于贵州省麻醉与器官保护基础重点实验室SPF级动物房，温度20～25℃，相对湿度40%～70%。按照中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》饲养和处理动物标准。

1.2 方法

采用随机数字表法将30只Balb/c小鼠分为三组，每组10只，分别为对照组、BU联合CY非清髓预处理（BU+CY）组和HSCT组。除对照组给予等量生理盐水外，其余两组先连续灌胃给予BU混悬液16 mg/（kg·d），4 d，再连续3 d腹腔注射CY溶液150 mg/（kg·d），第8天HSCT组进行HSCT，小鼠尾静脉移植脐带血造血干细胞0.3 mL（脐带血单个核细胞悬液5×106个细胞/只），对照组和BU+CY组尾静脉注射等量磷酸盐缓冲液（PBS）。

1.3 观察指标

1.3.1 一般状况和急性GVHD评分 给予BU后的第28天，称取小鼠体重，并密切观察小鼠活动、精神状态及皮毛疏密、光泽、饮食和存活情况，计算存活率，同时依照文献[8]进行急性GVHD评分，通过体重、体位、活动能力、毛发、皮肤完整性5个指标，每项指标按正常、轻、中、重度改变评定为0、1、2分，总分不超过10分。

1.3.2 睾丸指数 BU+CY预处理后第28天，麻醉后处死小鼠，称体重、双侧睾丸（含附睾）重量，按公式计算，睾丸指数=双侧睾丸重量（mg）/体重（g）。

1.3.3 组织病理学检查 留取两侧睾丸，肉眼观察睾丸大小和外观，取左侧睾丸和附睾，经4%多聚甲醛液固定后，送遵义医学院附属医院病理科，HE染色，显微镜下观察睾丸和附睾组织病理学变化。

1.3.4 精子检查 参照文献[9]的方法，将双侧附睾置于37℃、15 mL精子营养液的平皿中，剪碎附睾组织，静置2 h，使精子充分游离、释放出来，取5 μL精子悬液滴于精子计数板上，全自动精子分析仪（北昂医疗）检测出精子密度、活力。另取0.5 μL精子悬液滴于Testsimpletes玻片上，油镜下观测精子形态，计数200个精子，计算精子畸形率。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BU+CY及HSCT对一般状况和睾丸指数的影响

给予BU后第5天，除对照组外，其余两组小鼠逐渐表现出精神萎靡、体毛稀疏、无光泽、食欲及体重下降；第28天，BU+CY组和HSCT组小鼠体重开始逐渐恢复，两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。BU+CY组和HSCT组小鼠睾丸重量和睾丸指数均明显低于对照组（P < 0.01），而HSCT組睾丸指数高于BU+CY组（P < 0.05），见表1。HSCT以后，动物发生较强烈的移植物抗宿主反应，导致HSCT组小鼠死亡，对照组、BU+CY组、HSCT组小鼠存活率依次为100%、100%和50%。

2.2 BU+CY及HSCT对精子质量的影响

BU+CY组的精子密度、精子活力均显著低于对照组（P < 0.01），而精子畸形率均显著高于对照组（P < 0.01），HSCT组的精子密度显著低于对照组（P < 0.01），精子畸形率显著高于对照组（P < 0.01），而精子活力与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；HSCT组的精子密度和精子活力明显高于BU+CY组（P < 0.05），而精子畸形率明显低于BU+CY组（P < 0.01），但HSCT组的精子密度与畸形率均未恢复到对照组水平（表2、图1）。

2.3 BU+CY及HSCT对小鼠睾丸和附睾组织学变化的影响

肉眼可见，HSCT组小鼠睾丸体积较BU+CY组大，但小于对照组，睾丸表面光滑、饱满、色较粉润，而BU+CY组色较苍白（图2）。镜下可见，对照组小鼠睾丸生精小管完整，各级生精细胞排列整齐，层次清晰，管腔内有大量精子，支持细胞形态、数量正常。BU+CY组睾丸组织中生精小管完整性遭破坏，生精细胞排列紊乱，细胞肿胀明显，生精上皮层次减少虽不明显，但次级精母细胞和精子极少，生精小管管腔内渗出物较多。HSCT组睾丸组织细胞肿胀明显减轻，生精小管各层细胞虽数量较少，但已可见到少量次级精母细胞和精子，间质炎细胞浸润增多（图3）。三组附睾管官腔上皮细胞的组织学未见明显差异，但对照组附睾管管腔内精子数量较多，而BU睾管官组和HSCT明显较少（图4）。

3 讨论

化疗药物可引起短期的无精症，并使残存的生殖干细胞的分化存在较长的停滞期[9]，BU特异性地损伤生精干细胞和精原细胞，破坏精子产生，直接损害生精上皮，减少精子密度，减弱精子活性。CY则主要通过烷化作用，造成DNA损伤，而周期特异性地阻滞细胞增殖，产生生殖毒性，导致睾丸损伤，引起无精子症或少精子症，造成不育[10-12]。临床研究证实，儿童期因白血病、实体肿瘤或自身免疫性疾病接受CY治療的男性患儿，成年后80.2%～92.6%为无精子症或少精子症，可导致不育或者出现子代遗传性缺陷或畸形[13]。由此可见，非清髓预处理及异基因HSCT产生的睾丸生殖功能损伤，随着异基因HSCT治疗的逐渐增多，值得关注。

BU+CY非清髓预处理后，小鼠除一般状态较差外，睾丸指数、精子密度、精子活力均显著下降，而精子畸形率显著增高，睾丸生精小管完整性受损，生精上皮排列紊乱、次级精母细胞和精子数量锐减，附睾管中精子数量明显减少，表明BU+CY的处理，虽然满足了HSCT的需要，但在一定时期内，对睾丸生精功能和附睾管中精子均造成了损伤，引起的少精症、弱精症和精子畸形与文献报道相似[6]。

在BU+CY非清髓预处理基础上移植脐带血造血干细胞后，睾丸指数、精子密度和活力明显增高，精子畸形率降低，睾丸组织的病理改变也得到一定改善，生精小管结构完整性较好，次级精母细胞和精子数量有所增加，但仍低于正常对照水平，表明HSCT后，在小鼠急性GVHD较轻的情况下，受损的骨髓造血免疫功能和外周血血象短期内得到明显恢复的同时[14-15]，还可减轻非清髓化疗药物处理造成的睾丸损伤或促进损伤的修复，一定程度上改善睾丸的生精功能，但是HSCT治疗3周，睾丸的生精功能远不及正常对照，HSCT组的病理结果与文献报道相似[12，16]，表现出受鼠睾丸组织中存在明显的睾丸生殖和支持细胞的不足，从HSCT组小鼠高达50%的死亡率及存活小鼠GVHD评分来看[15]，HSCT后不同程度的GVHD可能也一定程度地影响了小鼠的生精功能。

小鼠的生精周期为36 d左右，尽管HSCT组睾丸生精功能得到了一定改善，但精子进入附睾及其发育成熟、活化尚未全部完成，而病理结果显示BU+CY和HSCT对附睾组织结构没有明显影响，但二者对精子活力及畸形率的改变，提示BU+CY可能对附睾管的功能有一定抑制，而HSCT一定程度提高了附睾管的功能。

此外，精子质量受到睾丸支持细胞、生精细胞与睾丸间质细胞相互作用、性激素及其受体活化、微环境细胞因子变化等多环节、多因素的影响[17]，且异基因HSCT后，严重的慢性GVHD也和受者的不育密切相关，因此非清髓预处理基础上HSCT对睾丸损伤保护作用的机制还需要进一步探讨，针对靶点，选择既可提高HSCT效果，又能减轻急性GVHD，同时可治疗不育症、减轻精子损伤或调节垂体-睾丸内分泌轴作用的药物或干细胞[17-19]，干预非清髓处理后HSCT受者的生精功能，可能是最为理想的策略。

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（收稿日期：2018-01-25 本文编辑：张瑜杰）