新生大鼠施万细胞体外培养的实验研究

周敏　胡鸣　何松明

[摘要] 目的 通過比较两种不同的新生大鼠施万细胞（SCs）原代培养的方法（双酶消化法与单酶消化法），探索出一种细胞纯度更高、获取时间更短的SCs细胞培养方法。方法 取4～5 d SD乳鼠双侧坐骨神经，分别采用单酶和双酶消化法，联合运用半植块法、差速消化法、差速贴壁法以及抗有丝分裂法原代培养纯化SCs。培养SCs 48 h和6 d后倒置显微镜观察两组细胞形态，7 d后分别进行SCs消化与传代，细胞计数板计数两组的SCs总数，传代48 h后用免疫荧光标记S-100蛋白对两组细胞进行鉴定，CCK-8测定细胞生长曲线。结果 用等量的神经组织，与单酶消化法比较，双酶消化法培养的SCs所获得SCs数目远高于单酶消化法所获得细胞数目（2倍以上）。免疫荧光结果显示，双酶消化法纯度[（95.29±1.71）%]高于单酶消化法[（72.41±2.16）%]（P < 0.05），两种方法P3代细胞生长曲线差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 在短时间内，用双酶消化法联合半植块法、差速消化法、差速贴壁法以及抗有丝分裂法可获得足量和高纯度的SCs。

[关键词] 施万细胞；原代培养；双酶消化法；单酶消化法

[中图分类号] R329.21 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（a）-0014-04

Experimental study on culturing Schwann cells of neonatal rats in vitro

ZHOU Min HU Ming HE Songming HUANG Guotao CHEN Qian HONG Li

Department of Gynecology and Obstetrics， People's Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To explore a culture of SCs method with higher cell purity and shorter time by comparing the two methods including the double-enzyme digestion and single-enzyme digestion of primary culture of Schwann cells （SCs） using the neonatal rats. Methods Bilaterally sciatic nerves were dissected from 4 to 5-day-old neonatal SD rats and double-enzyme digestion method and single-enzyme digestion method which both combined with hemi-explants-culture method， differential digestion method， differential adhesion method， and cytosine arabinoside were used to culture and purify SCs， respectively. The morphology of the SCs was observed under the inverted microscope at 48 hours and 6 days of culture. Then the SCs were digested and passaged after 7 days in culture and counted under the cell counter. The purity of SCs was identified by S-100 immunofluorescence staining. CCK-8 was used to measure the P3 cells growth curve， respectively. Results With the same number of neonatal rats， double-enzyme digestion method acquired SCs at least twice than single-enzyme digestion method. （95.29±1.71）% of S-100 positive SCs cultured were shown by immunofluorescence staining in the double-enzyme digestion method group， and （72.41±2.16）% in the single-enzyme digestion method group （P < 0.05）. There was no difference between the two cultures in the growth curve of P3 cells （P > 0.05）. Conclusion The double-enzyme digestion combined with hemi-explants-culture method， differential digestion method， differential adhesion method， and cytosine arabinoside may obtain sufficient amount of high-purity SCs in a short time and be applied in the further cytological experimental research on peripheral nerve regeneration.

[Key words] Schwann cell； Primary culture； Double-enzyme digestion method； Single-enzyme digestion method

施万细胞（Schwann cells，SCs）是一类特殊的神经胶质细胞，其包裹着外周神经轴突形成有髓神经纤维的髓鞘。当周围神经受损后，SCs与神经元之间的信号转导对神经轴突的生长和维持有重要作用[1-2]。SCs主要通过调节突触前神经轴突末梢的活动、产生神经营养因子，以及清除轴突、髓鞘碎片，在基底膜形成有效的基板，形成再生的神经元轴突生长的通道，从而促进轴突再生[3-6]。因此，研究周围神经再生就要求能够在短时间内高效率提供足量高纯度的SCs[7]。尽管当前SCs的原代分离、纯化和培养技术趋于成熟，但其获取细胞过程普遍存在复杂、耗时甚至纯度达不到要求等缺点。本文主要结合多种纯化方法比较两种消化方法体外培养SCs的纯度、数量及时间，探索出一种更加经济，便捷高效的原代施万细胞的分离，纯化培养方法，为后续细胞学实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

SD鼠婴（出生4～5 d），由武汉大学人民医院动物实验中心提供（NO.42009800002680）。DMEM/F12培养基、D-Hanks液（中国吉诺生物有限公司）；胎牛血清（美国Gemini公司）；两性霉素、阿糖胞苷（Ara-C）（美国Amresco公司）；Ⅰ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶和多聚赖氨酸（PLL）（美国Sigma公司）；兔抗S-100蛋白抗体（美国Abcam公司）；CCK8试剂盒（中国碧云天生物技术研究所）。

1.2 方法

1.2.1 SCs原代培养

选取出生4～5 d的SD鼠婴12只，冰冻处死，无菌分离坐骨神经后在解剖显微镜下剥去外膜，分别用含2.5 μg/mL的两性霉素的DMEM/F12培养液、含5%双抗的D-Hanks液和纯D-Hanks液浸泡5 min，然后置于配制好的全培养基（含20% FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基）中，组织剪剪碎至1～2 mm3大小，等体积均分为两组，离心收集组织块。第1组为单酶消化培养法组：组织中加入0.25%胰蛋白酶4 mL，置于37℃，5%CO2培养箱中培养30 min，期间每隔10 min取出置于混匀器混匀30 s，然后離心弃上清，再加入0.25%胰蛋白酶4 mL于培养箱中消化60 min，每隔20 min混匀30 s。第2组为双酶消化培养法组：加入0.2%Ⅰ型胶原酶1 mL和0.25%胰蛋白酶3 mL，置于培养箱内30 min，期间每隔10 min混匀30 s，离心弃上清，再加入0.2%Ⅰ型胶原酶4 mL于培养箱中消化60 min，每隔20 min混匀30 s。消化后两组均离心弃上清后用全培养基终止消化，再次离心弃上清，各加入全培养基3 mL，分别均匀接种于预铺有PLL的60 mm3培养皿。

1.2.2 SCs纯化和传代

差速贴壁去除成纤维细胞，在细胞培养30 min后吸出上清液体转入预铺PLL新的培养皿，培养箱中培养24 h，然后将两组均更换为含10 μmol/L Ara-C的全培养基，24 h后更换为新鲜全培养基，3 d后换液。待细胞长满80%，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶差速消化，待部分细胞变圆后，终止消化，离心弃上清液，加入全培养基吹打混匀后接种于预铺PLL的培养皿中，差速贴壁纯化2次，计数后将上清液置于T25培养瓶和铺有爬片的六孔板中于培养箱培养。

1.2.2 SCs的鉴定

1.2.2.1 SCs形态观察 每天定点在普通倒置显微镜下观察细胞形态，并拍照记录。

1.2.2.2 S-100免疫荧光染色鉴定 传代培养48 h后，取出爬片，PBS浸洗后，经过4%多聚甲醛固定，0.5% Triton-X100透化，山羊血清室温封闭30 min，anti-S-100一抗（1︰500）4℃孵育过夜，Alexa Fluor 594荧光二抗（1︰2000）湿盒避光37℃孵育1 h，DAPI染核5 min，封片，使用荧光显微镜观察并采集图像。

1.2.3 CCK8法检测SCs生长

将两组第3代（P3）的SCs细胞悬液等量分别接种于96孔板中，设置7组，每组5个复孔，培养箱孵育24 h，待细胞贴壁以后任取一组加入10 μL CCK8试剂，37℃孵育1 h后，酶标仪测定450 nm波长的吸光度，并做好记录，然后每隔24 h任取剩余组中的一组细胞，测定吸光度，取均值后绘制SCs增殖曲线。

1.3 统计学方法

采用Prism graphpad 5.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCs倒置显微镜观察

双酶法培养48 h后，即可观察到少量细小组织块及细胞爬出，在普通显微镜视野下可以看到爬出来的细胞中多数细胞体积较小，胞体边缘强透光性，呈现亮晕特征，且多数有两个长突起的梭形样细胞，有的细胞甚至有3个突起呈三角形样，这类细胞即为SCs。而剩下一些形状不规则、体积较大且透光性差，没有亮晕的细胞为成纤维细胞。单酶法培养48 h后可见大块组织块及少数细胞呈辐射状爬出，且成纤维细胞数目比双酶法较高。双酶法细胞增殖速度比较单酶法速度更快。接种6 d后，双酶组较单酶消化组长得更快，在25 cm培养瓶中，分别长满80%和40%（图1）。

2.2提取细胞数

两组细胞培养7 d后，分别消化后计数，单酶法可获得（0.69±0.12）×106个细胞，双酶法可获得（1.67±0.03）×106个细胞，两种培养方法比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 P0代SCs的获得时间

双酶法和单酶法培养SCs的收获时间分别是（8.0±0.5）、（12.0±0.5）d，两种培养方法比较差异有统计学意义（P < 0.05），双酶法收获SCs时间增快。

2.4 S-100免疫荧光鉴定

所有细胞核发出蓝色荧光，其中胞浆呈红色的为S-100阳性细胞，即SCs，部分细胞核大，颜色浅，且胞浆无红色荧光者为杂细胞。通过对视野细胞计数可以发现双酶法红色荧光比例较单酶法多，经计数后双酶法细SCs纯度可达（95.29±1.71）%，单酶法细胞纯度为（72.41±2.16）%，两种培养方法比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2（封三）。

2.5 细胞生长特征

通过CCK8方法分析两种方法下P3SCs生长曲线，结果显示两种方法比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。即：两组细胞在接种同样的数量前提下，其生长曲线相似。说明两种酶消化对细胞损伤无差异，均不影响细胞生长活力。见图3。

3 讨论

分离培养原代SCs常选择SD大鼠鼠婴的双侧坐骨神经，新生2 d内的鼠婴来源的周围神经较为柔嫩、细小、易断且与周围组织难以分离，而来源6 d后的以及成年的SD大鼠的SCs存在分裂增殖能力较弱的缺点且伴随着较多的杂细胞[8]。鉴于取材便捷和分离纯化后细胞的生长活力，本实验取材于出生4～5 d的SD鼠婴[9]。

目前关于SCs培养方法有很多，主要包括了酶消化法[10]，经典植块法[11]和免疫选择法[12]，但是上述培养方法均有缺陷。经典植块法通过反复贴壁获得SCs耗时较长且培养过程中伴有SCs分裂增殖能力的下降；单纯的酶消化法很难获得预期的纯度的SCs，容易掺杂其他细胞污染，如成纤维细胞；免疫选择法存在成本高且培养效率低下的缺点，因此难以达到研究需求的细胞量[13]。本实验基于大多研究人员报道的实验方法，用同样多的鼠婴，在细胞数量与纯度、培养时间上比较了半植块单酶消化法和半植块双酶消化法。结果显示在数量上双酶法有着比单酶法更好的优势，极大缩短了获得第一代细胞的时间，主要原因可能是利用胰蛋白酶消化去除组织中的间质，分散组织使细胞单层排列，结合Ⅰ型胶原酶消化成纤维细胞相对于SCs更为敏感，且对SCs细胞损伤较小的特性。双酶（胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶）法能够在保证细胞活力的前提下，将组织中成纤维细胞大量消化下来从而更加有利于SCs爬出，因此在数量上会比單酶法要有优势，有效的改善了SCs体外培养所获P0时间长，获得的SCs量少的不足且细胞能够多次传代后仍保持良好的增殖能力。此外，在体外接种同样数量比较P3代细胞增殖曲线发现，两种方法生长曲线基本重合，表明两种方法对细胞的损伤无差异，即SCs有着相似的活力，以上证据表明在同等损伤条件下，双酶法比单酶法能够更快获得P0代细胞，极大缩短获取预期纯度和数量的细胞的时间。

此外，为了分离纯度更高的具有高活力的SCs，除酶消化法结合半植块法之外，本研究还结合了其他常用的细胞纯化培养技术方法：①差速消化法[14]。差速消化法基于成纤维细胞比SCs对胰蛋白酶更耐受的特点进行分离纯化。SCs主要依赖突起黏附在皿底，而成纤维整个胞体都可以紧贴瓶底，因此对胰蛋白酶更加耐受，较SCs更难消化下来。因此只需要在传代时候快速胰酶消化下SCs，留下成纤维细胞在皿底就可以达到纯化目的[15]。②差速贴壁法[16]。差速贴壁法的原理是基于成纤维细胞比SCs对PLL黏附力较强的特点来进行分离纯化，细胞接种半小时后，将上清收集离心培养，为了最大限度减少SCs损失，可以采用双向差速贴壁法[17]。③Ara-C是一种有丝分裂抑制剂，能够对处于S期增殖的细胞起到特异抑制作用，其主要原理是能够阻止和干扰DNA的合成和复制过程[18]。因此Ara-C可以特异杀伤增殖较快的成纤维细胞从而达到纯化目的。由于Ara-C毒性大，长时间培养会导致SCs的活力受到影响，因此作用24 h后应更换培养基[19]。此外，有些研究报道为了去除杂细胞的污染，如成纤维细胞，利用相应的抗体来消除，但带来的问题也很明显，由于抗体的非特异性损伤会影响SCs后续生长活力，且多数抗体的成本较高，不能重复利用，因此想要获得大量的SCs显然是不可取的[20]。

综上所述，本研究采用的半植块双酶消化法培养SCs优于当前比较普遍的单酶消化方法。相比较于单酶法，双酶法能够在更短的时间内获得更多的高纯度的SCs，极大地缩短了细胞培养周期，且培养成本与单酶法相差无几。总的来说，双酶法完全可以替代当前的单酶法，是一种方便、快捷、高效的细胞培养方法，为后续细胞实验提供保障。

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（收稿日期：2018-01-12 本文編辑：任 念）