巨噬细胞和肺微血管内皮细胞对烟曲霉作用的研究

宋珺　韩菁　孙越

[摘要] 目的 探讨巨噬细胞和肺微血管内皮细胞对烟曲霉作用。 方法 构建小鼠巨噬细胞株J774细胞烟曲霉感染的体外模型和人肺微血管内皮细胞（HPMVECs）烟曲霉感染的体外模型，利用激光共聚焦扫描显微镜观察共培养体系。 结果 J774细胞对烟曲霉具吞噬作用，但在共培养24 h的动态观察中，并未观察到HPMVECs内化烟曲霉，仅观察到烟曲霉的感染导致HPMVECs形态的变化和细胞完整性的破坏。 结论 J774细胞对烟曲霉具吞噬作用，HPMVECs无内化烟曲霉的作用，烟曲霉感染可导致HPMVECs形态的变化和细胞完整性的破坏。

[关键词] 巨噬细胞；肺微血管内皮细胞；烟曲霉

[中图分类号] R563 [文獻标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（a）-0018-03

[Abstract] Objective To investigate effect of macrophages and pulmonary microvascular endothelial cells （HPMVECs） on Aspergillus fumigatus. Methods In vitro models of Aspergillus fumigatus-treated HPMVECs and Aspergillus fumigatus-treated J774 cells were established， confocal laser scanning microscope was used for detection of co-cultures. Results Aspergillus fumigatus were phagocyted by J774 cells. However， Aspergillus fumigatus were not internalized by HPMVECs， onlu morphology change and integrity compromise were observed on Aspergillus fumigatus-treated HPMVECs. Conclusion J774 cells phagocytes Aspergillus fumigatus. HPMVECs can't internalize Aspergillus fumigatus. Aspergillus fumigatus can cause morphology change and integrity compromise in HPMVECs.

[Key words] Macrophages； Pulmonary microvascular endothelial cells； Aspergillus fumigatus

在真菌感染中，曲霉菌是仅次于念球菌的重要致病菌[1-2]。导致人类疾病的主要曲霉菌是烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉，人类曲霉菌病95%以上为烟曲霉感染引发[1.3]。巨噬细胞属于免疫细胞，在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键作用。另外，侵袭性肺曲霉病的主要特征是烟曲霉菌丝侵袭血管。目前，烟曲霉与巨噬细胞（或血管内皮细胞）的相互作用成为学者们普遍关注的研究热点之一[1，4-6]。人肺微血管内皮细胞（HPMVECs）是肺组织的重要细胞，存在于循环血和实质脏器细胞之间，既是构成血管通透性的主要屏障，又是代谢功能复杂的炎症细胞，对维持肺血管的完整性具有特殊意义[7-9]。我们已经完成的研究表明，烟曲霉感染能引发HPMVECs分泌多种促炎因子[10]。然而，烟曲霉感染后，巨噬细胞和HPMVECs对烟曲霉有着何种作用，目前尚不清楚。在本研究中，我们拟建立烟曲霉与巨噬细胞（或HPMVECs）的共培养体系，对上述问题进行研究。

1 材料与方法

1.1 烟曲霉菌孢子悬液制备

取烟曲霉菌菌株（AF293）接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，37℃培养箱培养3 d，收集分生孢子悬液，通过8层无菌纱布过滤以去除菌丝，PBS液清洗5次，转入离心管中离心，弃上清，孢子重悬于PBS液中，计数后离心，重悬于PBS中，备用。带有绿色荧光蛋白（GFP）的孢子通过电转化法获得。

1.2 细胞培养

HPMVECs的培养参照文献[10]，培养液为专用内皮细胞培养液，J774细胞的培养液为DMEM培养液。于传代培养第5代，细胞达90%底壁后，上述细胞给予烟曲霉菌孢子处理。

1.3 细胞处理以及激光共聚焦扫描显微镜观察

细胞用胰酶消化后，用培养液重悬，取细胞悬液分别滴到铺于培养孔板中的细胞爬片上，30 min 后，补加完全培养液，置于37℃，5%CO2培养箱中培养6 h左右（让其贴壁更牢），然后将GFP标记的烟曲霉菌孢子刺激HPMVECs和小鼠巨噬细胞J774细胞，分别在2、4、8、16、24 h和0.5、2 h，用PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定（室温）1.5 h，PBS清洗3遍，分别用罗丹明-鬼笔环肽（Rhodamine phalloidin）室温孵育30 min，取出细胞爬片，用PBS 漂洗3遍，另外，于J774细胞，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色3 min，后PBS漂洗3遍，封片剂封片（有细胞一面对着载玻片），激光共聚焦扫描显微镜观察并拍照。本实验中，罗丹明-鬼笔环肽与胞浆内肌动蛋白（F-actin）结合而发红光，DAPI与细胞核结合发蓝光，携带GFP的孢子发绿光。

2 结果

2.1 烟曲霉的培养

烟曲霉菌菌株AF293于PDA培养基上，经37℃培养箱培养3 d后于普通显微镜下可见典型的烟曲霉圆形厚壁孢子和芽孢。见图1。

2.2 HPMVECs的形态学观察

HPMVECs用培养液接种于培养瓶中，培养24 h后，置于倒置显微镜下观察细胞形态，可见融合的单细胞层具有血管内皮细胞典型的铺路石样形态，但过度融合生长会因细胞过于紧密而呈现细长纺锤形。见图2。

2.3 小鼠巨噬细胞J774细胞的形态学观察

小鼠巨噬细胞株J774接种于培养瓶中，培养24 h后，置于倒置显微镜下观察细胞形态，可见贴壁生长的细胞呈单核细胞/巨噬细胞样，圆形或多角形。见图3。

2.4 建立烟曲霉与小鼠巨噬细胞株J774细胞（或HPMVECs）的共培养体系，探讨J774细胞（或HPMVECs）对烟曲霉的作用

J774细胞与煙曲霉共培养至0.5、2 h时，可见J774细胞均存在GFP阳性染色（图4，见封三），表明孢子被J774细胞吞噬。HPMVECs与烟曲霉共培养24 h的动态观察中，未见烟曲霉被HPMVECs内化，然而，与对照组比较，随着培养时间的延长，烟曲霉处理组HPMVECs出现形态的变化和细胞完整性的破坏（图5、6，见封三）。

3 讨论

本研究中我们成功构建HPMVECs烟曲霉感染的体外模型和小鼠巨噬细胞株J774细胞烟曲霉感染的体外模型，并观察到J774细胞对烟曲霉的吞噬作用，但在共培养24 h的动态观察中，我们并未观察到HPMVECs内化烟曲霉，仅观察到烟曲霉的感染可以导致HPMVECs形态的变化和细胞完整性的破坏。

巨噬细胞属于免疫细胞，在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键作用，它可以提呈抗原，吞噬、杀死胞内微生物或肿瘤细胞以及调节促炎和抗炎细胞因子的释放等[11-12]。巨噬细胞作为免疫防御的第一道防线，对机体抵抗烟曲霉孢子侵袭具有重要作用[13-14]。在本研究中利用激光共聚焦扫描显微镜我们观察到巨噬细胞对烟曲霉的吞噬。利用绿色荧光蛋白标记的烟曲霉感染巨噬细胞，我们可以在激光共聚焦扫描显微镜的视野中观察到烟曲霉显示清晰的绿色荧光，有利于观察孢子侵入宿主细胞的过程。既往研究表明，除巨噬细胞对病原微生物具有吞噬作用外，非专职吞噬细胞也可以主动内化病原微生物[1，5-6]。研究者以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为研究对象，观察到一定时间内有50%烟曲霉孢子内化进入HUVECs[5]。HPMVECs和HUVECs对烟曲霉的作用差异可能主要由于HPMVECs和HUVECs来源于不同的血管床，存在多方面的异质性。与巨噬细胞吞噬烟曲霉类似，烟曲霉对血管内皮细胞的侵袭、黏附涉及很多分子的参与[15-17]。目前研究较多的是内皮细胞表面的钙黏蛋白。白色念珠菌表面的凝集素同源物Als3为跨膜蛋白，其膜外存在特定的β折叠结构，该蛋白能与内皮细胞表面的钙黏蛋白结合，从而介导白色念珠菌进入宿主细胞[18-20]。

综上所述，在本研究中我们利用表达绿色荧光蛋白的烟曲霉感染巨噬细胞（J774细胞）和HPMVECs，观察到巨噬细胞具有对烟曲霉的吞噬作用，而HPMVECs对烟曲霉不具有内化作用，但引起HPMVECs结构完整性的破坏，在后续研究中我们将继续探讨烟曲霉与巨噬细胞（或HPMVECs）的相互作用及其机制。

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（收稿日期：2018-01-26 本文編辑：任 念）