结直肠癌miR—200a与miR—92a表达水平及其与临床病理特征的关系

杨新辉　赵为民　达热拜·热达提

[摘要] 目的 研究miR-200a、miR-92a在结直肠癌中的表达水平及其与患者临床病理特征的关系。 方法 选取2011年2月～2012年8月在新疆医科大学附属肿瘤医院接受手术治疗的结直肠癌患者60例，采集结直肠癌组织与癌旁组织标本各60例。采用原位分子杂交技术检测上述标本中miR-200a表达阳性率，采用实时荧光定量PCR法检测上述标本中miR-92a表达情况。分析miR-200a及miR-92a表达情况与结直腸癌患者的临床病理特征相关性。随访5年，根据生存状态分为存活组与死亡组，比较两组患者miR-200a、miR-92a表达情况差异。 结果 结直肠癌组织中miR-200a表达阳性率及miR-92a相对表达明显高于癌旁组织（均P < 0.05）。中高分化、TNM Ⅰ～Ⅱ期结直肠癌患者miR-200a表达阳性率明显低于低分化、TNM Ⅲ～Ⅳ期的结直肠癌患者，分别为40.00%（18/45）比73.33%（11/15）、58.06%（18/31）比86.21%（25/29），差异均有统计学意义（均P < 0.05）。而TNM Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移结直肠癌患者miR-92a相对表达量均明显低于TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移患者（均P < 0.05）。随访5年，生存组21例，死亡组39例。存活组miR-200a表达阳性率及miR-92a相对表达量均明显低于死亡组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 结直肠癌组织的miR-200a、miR-92a高表达，与病情严重程度及预后密切相关。

[关键词] 结直肠癌；miR-200a；miR-92a；临床病理特征；预后评估

[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（a）-0063-05

[Abstract] Objective To analyze the expression of miR-200a and miR-92a in colorectal cancer and the relation of clinicopathological features. Methods The 60 patients with colorectal cancers in Affiliated Tumor Hospital， Xinjiang Medical University for surgical treatment from February 2011 to August 2012 were collected. And the 60 colorectal cancer tissue specimens and paracancerous tissues were achieved in patients with colorectal cancer respectively. The positive expression rates of miR-200a in colorectal cancer tissues and paracancerous tissues were detected by in situ hybridization technique. The expression levels of miR-92a in colorectal cancer tissues and paracancerous tissues were detected by real-time PCR. The relativities of the expression of miR-92a and miR-200a and the clinicopathological features were analyzed. Follow-up 5 years， all patients with colorectal cancers were divided into survival group and death group according to the survival status of patients. The expression levels of miR-92a and miR-200a were compared between two groups. Results The positive rate of miR-200a and the expression level of miR-92a in colorectal cancer tissues were significantly higher than in paracancerous tissues （all P < 0.05）. The positive expression rates of miR-200a in the colorectal cancer patients of the middle and high degree of differentiation and TNM stage Ⅰ-Ⅱ were significantly lower than those of the low degree of differentiation and TNM stage Ⅲ-Ⅳ， which were 40.00%（18/45） vs. 73.33%（11/15）， 58.06%（18/31） vs. 86.21%（25/29） （all P < 0.05）. The relative expressions of miR-92a in colorectal cancer patients of the TNM stage Ⅰ-Ⅱ and without lymph node metastasis were significantly lower than those of the TNM stage Ⅲ-Ⅳ and lymph node metastasis， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Follow-up 5 years， the survival group had 21 cases and death group had 39 cases. The positive rate of miR-200a and the relative expression of miR-92a in survival group were significantly lower than death group， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion The expression levels of miR-200a and miR-92a are highly in colorectal cancer， and are closely associated with the severity and prognosis.

[Key words] Colorectal cancer； miR-200a； miR-92a； Clinicopathological features； Prognosis evaluation

结直肠癌发病早期具有较强的隐匿性，具有较高的发病率，预后不良[1]。其中早期结直肠癌患者的5年生存率可达90%，而晚期与发生转移的结直肠癌患者5年生存率在15%以下[2-3]。因此，寻找一种有效的方式对结直肠癌患者进行诊断评估显得尤为重要。本文通过研究miR-200a、miR-92a在结直肠癌中的表达与临床病理特征关系，旨在为临床诊治提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年2月～2012年8月在新疆医科大学附属肿瘤医院接受手术的结直肠癌患者60例，分别采集患者结直肠癌组织标本与癌旁组织标本各60例。其中男36例，女24例；年龄44～78岁，平均（65.4±10.3）岁；肿瘤直径3～7 cm，平均（4.6±1.3）cm；分化程度：低分化15例，中高分化45例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期29例；浸润深度：T1～T2有18例，T3～T4有42例；有淋巴结转移30例，无淋巴结转移30例。纳入标准：①均符合WHO关于结直肠癌的诊断标准，并经手术病理检查确诊为结直肠癌；②均采取手术治疗；③术前未接受放化疗以及其他抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他肿瘤；②术前接受过抗肿瘤治疗。所有患者均知情并签署了同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 采用原位分子杂交技术检测标本中miR-200a的表达[4] 具体如下：组织切片行常规处理，同时灭活内源性酶。取3%胃蛋白酶完全消化后，1%多聚甲醛进行固定10 min，蒸馏水清洗3次，加入预杂交液20 μL，38℃恒温箱中培养4 h。滴入含地高辛标记的寡核苷酸探针及20 μL预杂交液[5]。38℃恒温箱中杂交过夜，分别取37℃的2×SSC洗涤2次，5 min/次；0.5×SSC洗涤1次；0.2×SSC洗涤1次。加入封闭液及生物素化鼠抗地高辛，在37℃下反应60 min，PBS洗涤4次；滴加SABC反应20 min，PBS洗涤3次；滴加生物素化过氧化酶继续反应20 min，PBS洗涤4次，DAB显色，苏木精复染，予以脱水透明封片[6]。以探诊稀释液替代探诊为阴性对照组，用已知阳性切片为阳性对照。

1.2.2 采用实时荧光定量逆转录PCR法检测标本中的miR-92a表达情况 具体方式如下：严格按照Trizol试剂说明书对结直肠癌组织中的总RNA进行提取[7]，并参照RNA逆轉录试剂盒说明书进行逆转录处理。PCR反应条件如下：42℃ 60 min，70℃ 10 min。取1 μL的cDNA进行PCR扩增，反应条件如下：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min，40个循环。操作时严格做好实验室及操作台面的质控措施。其中miR-92a表达情况采用绝对定量法进行计算，试验重复3次，取平均值。

1.3 评价标准

miR-200a以细胞质中发现黄色或棕黄色颗粒为阳性，并采用半定量积分法对结果进行判定[7]：①根据着色细胞染色强度评分：0分无着色；1分淡黄色；2分棕黄色；3分棕褐色。②根据阳性细胞数占比评分：1分阳性细胞数占比≤10%；2分阳性细胞数占比>10%～25%；3分阳性细胞数占比>25%～50%；4分阳性细胞数占比>50%，两项评分乘积为最后积分，积分为0～2分为阴性，3～12分为阳性[7]。

1.4 观察指标

比较结直肠癌与癌旁组组织中的miR-200a、miR-92a表达情况，分析miR-200a、miR-92a表达与结直肠癌患者临床病理特征关系，对比结直肠癌5年存活组患者与死亡组患者miR-200a、miR-92a表达情况。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，非正态分布的计量资料以中位数（M）四分位数间距（P25，P75）表示，予以非参数H检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁组织miR-200a、miR-92a表达情况比较

结直肠癌组织中miR-200a表达评分及miR-92a相对表达明显高于癌旁组织（P < 0.05）。见表1、图1。

2.2 miR-200a在结直肠癌表达与临床病理特征关系分析

中高分化、TNMⅠ～Ⅱ期结直肠癌患者的miR-200a表达阳性率分别为40.00%（18/45）、58.06%（18/31），均明显低于低分化、TNM Ⅲ～Ⅳ期的73.33%（11/15）、86.21%（25/29）（P < 0.05）。见表2。

2.3 miR-92a在接直肠癌中的表达与临床病理特征关系分析

TNMⅠ～Ⅱ期、无淋巴结转移结直肠癌患者的miR-92a相对表达量均明显低于TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移者（P < 0.05）。见表3。

2.4 结直肠癌患者5年生存情况与miR-200a、miR-92a表达的关系

结直肠癌5年存活组患者miR-200a表达阳性率及miR-92a相对表达量均明显低于死亡组（P < 0.05）。见表4。

3 讨论

随着我国人们生活水平的不断提高以及饮食习惯的逐渐改变，结直肠癌的发病率与病死率均呈逐年上升趋势[8-9]，其癌变的发生、进展是一种多基因、多步骤的复杂过程，因此深入研究结直肠癌的具体发病机制，对临床结直肠癌的早期诊断、指导治疗以及预后评估均有极其重要的意义[10-11]。而miRNA是一类存在于真核生物中的非编码小分子RNA，其主要作用是通过与靶mRNA的3，-UTR进行互补配对[12-13]，从而对蛋白合成进行抑制或促进mRNA的降解，进一步在转录后水平对目的基因表达进行调控[14-16]。

本研究发现，结直肠癌组织中miR-200a表达阳性率以及miR-92a相对表达量均明显高于癌旁组织，说明了miR-200a与miR-92a可能在结直肠癌的发生、发展过程中发挥着至关重要的作用。此外本研究也提示了miR-200a在结直肠癌组织中的表达情况与分化程度和临床分期存在密切相关，可能在结直肠癌的进展过程中发挥着重要作用。因此，在临床工作中可通过对miR-200a表达情况进行检测，从而可能对结直肠癌进行早期诊断，明确患者病情严重程度，从而合理制订治疗方案。另外，本研究提示了miR-92a可能参与了结直肠癌的病情进展以及淋巴结转移过程，这一点与国外研究结论是相一致的[17-18]。因此在临床工作中可通过对miR-92a表达情况进行检测，进一步有效评估患者病情严重程度以及淋巴结转移情况，为临床治疗方案的制订提供参考信息。本研究结果还显示了结直肠癌5年存活组患者miR-200a表达阳性率以及miR-92a相对表达量均明显低于死亡组，这提示了miR-200a与miR-92a表达与结直肠癌患者的预后存在密切相关，这一点也得到国外临床研究的证实[19-20]。临床上可通过对上述两项指标表达情况进行检测，从而对结直肠癌患者进行预后评估。且上述两项指标表达越高，患者预后越差。

综上所述，miR-200a、miR-92a在结直肠癌均存在明显高表达，且与患者病情严重程度及预后存在密切相关。可通过对上述两项指标表达情况进行检测，从而对结直肠癌患者进行诊断、预后评估。由于本研究尚存在样本量不足的缺陷，从而可能导致影响结果可信度，因此本研究结果应在后继的多中心大样本研究中予以进一步证实。

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（收稿日期：2017-12-24 本文编辑：任 念）