改良的Pulsinelli四血管夹闭法建立大鼠脑缺血模型

刘小艳　严德萍　陈建鸣

【摘要】 目的：通過改良Pulsinelli四血管夹闭法制备大鼠脑缺血模型，为脑卒中的研究提供有效的动物模型。方法：实验选用健康成年雄性Wistar大鼠，随机分为对照组、假手术组和缺血模型组，自由饮食。术前禁食过夜，用水合氯醛麻醉（40 mg/100 g，腹腔注射），将大鼠固定于操作台上。沿第一颈椎内斜向上的神经来寻找翼突孔，用尖端细长的电烙铁电凝双侧翼小孔下方的椎动脉，缝合皮肤。颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线并缝合皮肤，夜间禁食。次日，用动脉夹夹闭清醒大鼠的双侧颈总动脉15 min，造成短暂前脑缺血。假手术组中除不电凝椎动脉和不夹闭颈总动脉外，其他操作与模型组相同。对照组不做任何处理。结果：大鼠造模成功43只，成功率为66.2%，模型成功后存活40只，存活率为93.0%。尼氏染色显示，对照组大鼠与假手术组大鼠海马CA1区神经元排列紧密整齐，结构正常，细胞核圆而规则。缺血模型组大鼠海马CA1区正常神经元数量显著减少，大量锥体神经元变性坏死，细胞核不规则并固缩深染，细胞间隙明显增大。结论：改良的Pulsinelli四血管夹闭法可以制备理想的大鼠脑缺血模型，成功率高，适合缺血性脑卒中的实验研究。

【关键词】 脑卒中； 动物模型； Pulsinelli四血管夹闭法； 大鼠

Establishment of Cerebral Ischemia Model in Rats by Modified Pulsinelli Four-vessel Occlusion Method/LIU Xiaoyan，YAN Deping，CHEN Jianming，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（14）：029-032

【Abstract】 Objective：To establish a rat model of transient cerebral ischemiaby a modified Pulsinelli four-vessel occlusion method，which provided an effective animal model for the study of stroke.Method：Adult male Wistar rats were randomly divided into control group，sham operation group and ischemic group，free diet.Rats were fasted overnight and anesthetized with chloral hydrate（40 mg/100 g，i.p.），the rats were fixed on the console.Along the first cervical vertebra oblique nerve to find the wing protruding hole，bilateral vertebral artery below the pinhole were electro-coagulatedwith a sharp slender，and sutured the skin.The common carotid arterieswere separated，and rats were fasted at night.The next day，the common carotid artery was clamped for 15 min，resulting in transient forebrain ischemia.In the sham operation group，except the non-occlusion vertebral artery and the common carotid artery，the other operations were the same as the model group. The control group did not do any treatment.Result：Ischemic model were successfully established in 43 rats，with a success rate of 66.2% and 40 surviving after a successful model，the survival rate was 93.0%.Nissl staining showed that neurons in hippocampal CA1 region of rats in control group and sham operation group were arranged closely and neatly， with normal structure and regular nuclei.The number of normal neurons in hippocampal CA1 area of ischemic model group was significantly reduced.A large number of pyramidal neurons degenerated and necrotic，the nucleus was irregular and contracted deeply，and the intercellular space was significantly increased.Conclusion：The modified Pulsinelli four-vessel occlusion method can be used to establish an ideal model of cerebral ischemia in rats with high success rate and suitable for the experimental study of ischemic stroke.

【Key words】 Stroke； Animal model； Pulsinelli four-vessel occlusion； Rat

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.14.007

缺血性脑卒中是由于向脑组织提供血液的血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一种疾病，颈内动脉和椎动脉闭塞可引起缺血性脑卒中[1]。脑卒中已成为我国第一位死亡原因，也是中国成年人残疾的首要原因，具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，严重危害人类健康和生活，至今没有很好的治疗方法[2-3]。在缺血性脑血管病的基础研究中，建立稳定、可靠及操作简便的动物模型是开展各项研究的基础[4]，也是评价不同的治疗方法所必需的[5]。目前公认的Pulsinelli大鼠前脑缺血四血管模型是研究多种缺血性脑疾病经典模型之一。大鼠四血管闭塞可引起严重的前脑缺血，但不影响脑干生命中枢的血液供应，其血液供应基本不减少，为正常灌注的96.31%[6]。而且该方法可较好地模拟临床上因低血压休克、心肺脑复苏等造成的前脑缺血性损伤过程。因此，近年来经典的Pulsinelli四血管夹闭法被许多学者所使用[7]。尼氏染色法是评价改良的Pulsinelli四血管夹闭法是否能成功建立大鼠脑缺血模型的常用方法。尼氏体是胞质内的一种嗜碱性物质，广泛见于各种神经元。在尼氏染色中尼氏体清晰可辨，尼氏体受染后呈块状或颗粒状。生理情况下，尼氏体大而数量多；神经元受损时，尼氏体数量可减少甚至消失。短暂脑缺血会诱发神经损伤，特别是在大鼠海马的CA1区尼氏体数量显著减少[5]。

1 材料与方法

1.1 动物 健康成年雄性Wistar大鼠85只，体重200～250 g。由山西医科大学动物中心提供。大鼠饲养于12 h昼夜循环的安静的环境中，室温为（23±2）℃，湿度为（60±10）%，每组分笼饲养，每笼放2只，术前适应新环境1周，自由摄食饮水。将大鼠标号后通过随机数字表分为对照组（10只）、假手术组（10只）和脑缺血模型组（65只）。

1.2 模型制作方法 模型组用质量分数4%的水合氯醛（生产厂家：天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：Q/12HB 4218-2009）进行腹腔麻醉（1 mL/100 g）[8]，将大鼠俯卧固定于操作台上，头向下倾斜与平面呈大约30°[9]，颈后备皮，消毒，于枕部第一颈椎水平处做一个1～2 cm的纵向切口，分离筋膜和肌肉，以第一颈椎上穿出的神经为标志，暴露第一颈椎翼突孔[10]，用电烙铁烧灼双侧椎动脉4～5次，4～5 s/次，缝合切口，消毒。将大鼠仰卧固定于操作台上，頸前部位备皮，消毒，颈前正中部位做一个1.0～1.5 cm的纵切口，在气管两侧仔细分离出双侧颈总动脉约1 cm，穿线以备次日用。术后青霉素（生产厂家：华北制药股份有限公司，批准文号：国药准字H13020656）用4 mL 0.9%氯化钠溶液溶解后取0.2 mL给大鼠腹腔注射防止感染。24 h后，把完全清醒的大鼠用合适的手法固定，消毒，拆开颈部缝合线，提起颈总动脉下的备用线，用微创动脉夹夹闭两侧颈总动脉。夹闭15 min后放开动脉夹，恢复血液供应，缝合切口。术后将大鼠放在干净的笼中单独饲养。假手术组除不电凝椎动脉和不夹闭颈总动脉外，其他操作与模型组相同。对照组不做任何处理。造模时观察电凝椎动脉的最佳部位，夹闭双侧颈总动脉后观察大鼠的意识状态、瞳孔大小、对光反射和翻正反射。

1.3 观察指标与判断标准 观察缺血损伤后脑组织的病理组织学改变。（1）取材及病理学检查。7 d后大鼠经腹腔麻醉后开胸暴露心脏，经升主动脉插管，用200 mL 4 ℃生理盐水心脏灌注冲洗血液后立即更换4%的多聚甲醛300 mL先快后慢，待大鼠僵硬，肝肺泛白后，立即断头取全脑组织浸入多聚甲醛溶液中继续固定24 h，用30%的蔗糖脱水，之后作冠状面冰冻切片，尼氏染色观察海马CA1区和CA3区的结构变化。（2）模型成功指征。脑缺血模型制作成功的标准是：在夹闭双侧颈总动脉后大鼠在30～60 s内昏迷，意识丧失，翻正反射消失，双眼球苍白，双侧瞳孔放大且对光反射消失，能自主呼吸。在夹闭15 min内上述反应均未恢复。实验过程中凡不符合上述标准或大鼠出现抽搐及死亡视为失败。偏瘫和癫痫的大鼠排除进一步实验[10]。

2 结果

2.1 实验动物生存情况 大鼠模型组65只，造模成功43只，成功率为66.2%，模型成功后存活40只，存活率为93.0%。

2.2 组织学检查 尼氏染色显示，与假手术组相比，脑缺血模型组大鼠海马脑区中CA1区神经元数量显著减少，CA3区神经元无明显变化（图1）。假手术组CA1区神经元排列紧密整齐，结构正常，细胞核圆而规则，核膜清楚，有明显的核仁，核膜境界清楚；脑缺血模型组大鼠海马CA1区正常神经元数量显著减少，大量锥体神经元变性坏死，细胞核不规则并固缩深染，细胞间隙明显增大，胞浆呈空泡样变（图2）。

3 讨论

四血管阻塞法是前脑缺血模型常用的制作方法，在1979年Pulsinelli和Brierley首次利用四血管闭塞法成功建立了大鼠前脑缺血再灌注模型，利用四血管阻塞法制作大鼠前脑缺血再灌注模型的解剖学基础在于：大鼠腹侧的脊髓动脉具有一个走向脑干的返支，四血管闭塞期间可维持脑干的血液供应，使动物得以存活[11]。啮齿动物的大脑血管和人类的大脑血管解剖特征非常相似，因此啮齿动物常被用于脑缺血实验模型中[12]。

经典的Pulsinelli电凝椎动脉后4 d分离双侧颈总动脉，实验周期长，易造成大鼠缺血缺水死亡。在本实验中，经过改良的手术方法：烧灼大鼠第一颈椎上双侧翼孔，闭塞双侧椎动脉。分离双侧颈动脉；动物存活24 h后，在清醒状态下夹闭双侧颈总动脉，造成前脑缺血。因该方法缺血效果确切，模型重复性及可比性较强而被广泛应用。本方法的优点在于：（1）斜背向头侧烧灼闭塞双侧椎动脉，一方面是由翼突孔的生理形态决定，也可以避免造成局部产热过高而损伤脊髓和脑干[13]。（2）烧灼最佳时间：4～5 s/次，每侧烧灼4～5次。（3）术后护理大鼠。术后大鼠身体状况较差，加上缺血再灌注对脑的损伤，因此对大鼠的护理也是影响模型成功率的因素之一，定时给其清洗眼睛，畅通呼吸道，避免伤口感染[14]。另外，相同的操作方法用不同的操作者和不同的固定及放松大鼠手法也能改变大鼠四血管闭塞的程度反应[9]。这种造模方法成功率很高，不需要准备大量动物，缺血性神经元损伤大，癫痫的发生率低[10]。也可以避免造成大鼠大脑缺血的其他方法引起的并发症，可以出现在文献中组织病理学中描述的前脑缺血的特征[15]。

前脑缺血模型对于人类卒中的研究是必须的，然而不可视的电凝椎动脉的方法可造成不完全的闭塞，使模型失败[16]。也存在操作复杂、椎动脉阻断困难、术中死亡等缺点。椎动脉为大鼠大脑提供充足的血流，若大鼠没有完全昏迷或者反应灵敏，表明椎动脉没有完全闭塞[9]。有些大鼠存在变异，第一颈椎上的翼孔开口较小或缺失，或存在两个开口。若直接烧灼，往往不能完全闭塞椎动脉。夹闭双侧颈总动脉后，通过观察大鼠神经体征的改变作为判定达到前脑缺血的标准，易受观察者主观因素的影响，因此需要在组织学水平最终确定缺血效果[11]。实验组织病理学的变化证明笔者采用的前脑缺血再灌注损伤大鼠模型是成功的。

本研究中仍使用液体麻药，在以后实验中可以在全程乙醚麻醉下操作的方法，避免麻药的使用[10]；缺血大鼠显示梗死面积增加，可用脑核磁来检验和筛选最佳模型；缺血大鼠也显示大鼠习惯化减弱，焦虑和自主活动增加，可用高架十字迷宫等测大鼠行为[17]；大鼠模型成功后缺血造成大鼠始终不变的体位变化。大鼠大脑损伤的两半球对称性和强度与体位改变的出现和维持以及维持时间有关[15]。可通过观察其体位变化辨别模型成功率的高低。

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（收稿日期：2017-12-25） （本文編辑：张爽）