健脾消癌方对人结肠癌HCT116细胞周期、凋亡及Wnt/β—catenin信号通路相关因子的影响

杨晓　唐蔚　蒋益兰

摘要：目的 观察健脾消癌方对Wnt/β-catenin信号通路相关因子及人结肠癌HCT116细胞周期、凋亡的影响，探讨其抗大肠癌复发转移的作用机制。方法 将对数生长期的HCT116细胞分为空白组、生理盐水组、5-Fu组及健脾消癌方低、中、高剂量组，分别干预48 h，收集细胞，采用流式细胞术检测细胞周期、凋亡，Western blot检测细胞核内β-catenin蛋白表达，PCR检测c-myc、cyclinD1 mRNA表达。结果 与空白组及生理盐水组比较，健脾消癌方各剂量组HCT116细胞凋亡比例、G1期细胞比例增加，S期细胞比例降低，且其细胞核内β-catenin蛋白表达降低，c-myc、cyclinD1 mRNA表达降低，尤以健脾消癌方高剂量组明显，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结论 健脾消癌方可促进人结肠癌HCT116细胞凋亡并将其细胞周期阻滞，其机制可能与调节Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词：健脾消癌方；大肠癌；Wnt/β-catenin信号通路；细胞凋亡；细胞周期

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.015

中圖分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0061-05

Effects of Jianpi Xiaoai Prescription on Cell Cycle and Apoptosis of Human Colon Cancer HCT116 Cells and Wnt/β-catenin Signaling Pathway Related Proteins

YANG Xiao1， TANG Wei2， JIANG Yi-lan2， TAO Zi-hao1， LIU Ke1， SONG Cheng3

1. Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；

2. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China；

3. Hunan Cancer Hospital， The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine，

Central South University， Changsha 410006， China

Abstract： Objective To study the effects of Jianpi Xiaoai Prescription on cell cycle and apoptosis of human colon cancer HCT116 cells and related factors of Wnt/β-catenin signaling pathway； To investigate its mechanisms of anti-metastasis and recurrence of colorectal cancer. Methods The logarithmic growth phase HCT116 cells were divided into blank group， saline group， 5-Fu group， and Jianpi Xiaoai Prescription low-， medium-， and high-dose groups. After intervention for 48 h， the cells were harvested， and the cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The protein expression of β-catenin in the nucleus was detected by Western blot， and the expression of c-myc and cyclinD1 mRNA was detected by PCR. Results Compared with the blank group and saline group， the ratio of HCT116 cells apoptosis of Jianpi Xiaoai Prescription low-， medium-， and high-dose groups increased； the proportion of cells in phase G1 increased and the proportion of S cells decreased； the expression of β-catenin protein in the nucleus and the expression of c-myc， cyclinD1 mRNA decreased， especially in the Jianpi Xiaoai Prescription high-dose group， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Jianpi Xiaoai Prescription can promote apoptosis of human colon cancer HCT116 cells and block the cell cycle， and its mechanism may be related to regulating Wnt/β-catenin signaling pathway.

Keywords： Jianpi Xiaoai Prescription； colorectal cancer； Wnt/β-catenin signaling pathway； apoptosis； cell cycle

大肠癌（colorectal cancer，CRC）指发生于结肠及直肠的恶性肿瘤。近年来，随着生活方式及饮食结构的改变，我国CRC发病率急剧上升。目前，CRC的治疗仍以外科手术为主，辅以化学药物、放射、靶向药物等治疗，术后5年生存率约50%。近年来，本课题组运用中药复方健脾消癌方治疗结直肠癌患者已达1万余人次，临床疗效较好[1-3]，但其作用机理尚不明确。研究表明，Wnt信号通路可通过影响细胞凋亡、增殖和分化等生命活动参与结直肠癌的发生和发展[4]，大约90%结直肠癌患者存在Wnt信号通路的异常[5]。本实验以人结肠癌HCT116细胞为实验对象，研究健脾消癌方对CRC细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路相关因子的影响，探讨其抗CRC复发转移的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF級雄性健康Wistar大鼠15只，4～6周龄，体质量（300±20）g，长沙斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号SCXK（湘）2016-0002，饲养于湖南省中医药研究院动物房，温湿度适宜，人工12 h昼/夜循环照明，灌胃前适应性饲养3 d。

1.2 细胞

人结肠癌HCT116细胞，上海生物医学工程研究所。

1.3 药物

健脾消癌方（人参10 g，白术10 g，法半夏10 g，灵芝10 g，黄芪20 g，茯苓15 g，薏苡仁30 g，淫羊藿10 g，莪术10 g，白花蛇舌草30 g，半枝莲30 g，蚤休10 g，麸炒枳壳8 g，郁金15 g，甘草6 g），饮片购自湖南省中医药研究院附属医院门诊中药房。将上药加入10倍量水浸泡1 h，煎制1 h，过滤，将滤液储存，再加入8倍量水，煎煮1 h，过滤，合并2次滤液，浓缩至3 g原药材/mL，置于4 ℃冰箱保存备用。5-氟尿嘧啶（5-Fu），0.25 g/支，北京紫竹药业有限公司，批号01646346Y。

1.4 主要试剂与仪器

DMEM培养基（美国Gibco公司），PBS缓冲液（杭州四季青），胎牛血清（FBS，杭州四季青），乙醇（上海化学试剂有限公司），胰酶（上海碧云天生物技术有限公司），Tris（美国Sigma公司），SDS（美国Sigma公司），TEMED（美国Sigma公司），Tween-20（美国Sigma公司），RIPA裂解液（北京普利莱），蛋白酶抑制剂（德国Merck公司），兔β-catenin一抗（美国Proteintech公司），显影液（中国Well Biology公司），反转录试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），Trizol（美国Invitrogen公司），引物（上海生工生物有限公司）。台式冷冻离心机（深圳黑马TGL-18R），超净工作台（法国Jouan MSC12），摇床（江苏其林贝尔TS-92），电泳仪（美国Bio rad公司，164-5050），电泳槽（北京六一仪器厂，DYCZ-24EN），转膜仪（北京六一仪器厂，DYCZ-40A），荧光定量PCR仪（美国Thermo公司，SPL0960），流式细胞仪（美国Bio-rad公司），高压消毒锅（长沙厚益深泰医药科技有限公司），电热干烤箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

2 实验方法

2.1 药物血清制备

参照文献[6]方法制备健脾消癌方药物血清及生理盐水对照血清。药物血清组大鼠给药量按人与大鼠等效剂量换算为10 g/kg，健脾消癌方高、中、低剂量组大鼠分别给予20、10、2.5 g原药材/（kg·d）健脾消癌药液灌胃，生理盐水组大鼠给予15 mL/（kg·d）生理盐水灌胃，每日1次，灌胃前空腹12 h，连续15 d，于第15日最后1次灌胃后30 min，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，腹主动脉采血，3000 r/min离心30 min，吸取上清液即血清，合并同组血清，56 ℃水浴30 min灭活补体，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，无菌试管分装并标记类别及日期，置于-20 ℃冰箱内保存备用。

2.2 细胞培养

人结肠癌HCT116细胞，用含10%FBS的DMEM高糖培养基，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。细胞铺满培养瓶底80%～90%时予以胰蛋白酶消化、传代，约2 d传代1次。

2.3 分组及给药

取对数生长期细胞，调整浓度为1.5×105个/mL，取6孔板2块，每孔加入上述细胞悬液2 mL，分别设为空白组、生理盐水组、5-Fu组和健脾消癌方低、中、高剂量组，每组2孔。细胞铺板完成后静置12 h，换成含药培养液。空白组：5%FBS+10%FBS+DMEM培养基；生理盐水组：5%生理盐水对照血清+10%FBS+DMEM培养基；5-Fu组：1 μg/mL 5-Fu+10%FBS+DMEM培养基；健脾消癌方低剂量组：5%低浓度药物血清+10%FBS+DMEM培养基；健脾消癌方中剂量组：5%中浓度药物血清+10%FBS+DMEM培养基；健脾消癌方高剂量组：5%高浓度药物血清+10%FBS+DMEM培养基。放回培养箱继续培养48 h。

2.4 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡

各组细胞给药培养48 h后用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS悬浮，2000 r/min离心5 min，洗涤细胞2次，收集约1×105～5×105个细胞，加500 μL Binding buffer悬浮细胞，再加5 μL Annexin V-FITC混匀后，加5 μL Propidium iodide，混匀，室温避光，反应5～15 min。1 h内于流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。

2.5 Western blot检测细胞核内β-catenin蛋白表达

收集细胞，用冰预冷的PBS洗涤细胞，3000 r/min离心2 min，弃上清液。加300 μL CER試剂，反复吹打混匀，冰上裂解15 min，4 ℃、800 r/min离心5 min，弃上清液，加300 μL NER，重悬沉淀，4 ℃、4000 r/min离心5 min，弃上清，再次冰上裂解15 min，4 ℃、800 r/min离心5 min，弃上清液，加50～80 μL Suspension Buffer重悬沉淀，得核蛋白。经电泳及转膜后加入含5 g/100 mL脱脂奶粉的TBST，封闭60 min，加入β-catenin一抗（稀释比例1∶200），4 ℃过夜，TBS-T洗3次后将稀释的二抗（HRP标记，稀释比例1∶4000）与膜共同孵育45～60 min。TBS-T洗3次后，采用化学发光试剂曝光显影。

2.6 PCR检测细胞c-myc、cyclinD1 mRNA表达

收集细胞，Trizol提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，以组织总mRNA为模板，反转录成cDNA，反转录反应体系20 μL：3 μL RNA，2 μL Random primer，5 μL无菌DEPC处理水，70 ℃加热5 min，迅速插入碎冰中冷却，再依次加入4 μL 5×Reaction buffer、4 μL dNTP、1 μL RNase inhibitor，37 ℃加热5 min，再加入1 μL M-MLV反转录酶，42 ℃放置1.5 h，转72 ℃反应10 min，得cDNA。SYBR法检测基因表达：实时定量PCR（每个样本每个指标3个孔，共30 μL体系，每孔9 μL）。体系组成：Template 2 μL，Primer F（10 μmol/L）0.5 μL，Primer R（10 μmol/L）0.5 μL，PCR H2O 12 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 15 ?L。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 50 s，共40个循环。在NCBI上搜索目的基因序列，运用primer5软件设计引物，由上海生工合成引物。引物序列见表1。

3 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，数据符合正态分布及方差齐性时，组间比较用独立样本t检验，多组间比较用方差分析，多重比较用LSD法；数据不符合正态分布或方差不齐时，用非参数检验中多个独立样本Kruskal-Wallis H检验；计数资料以例数或百分率表示，组间比较用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 健脾消癌方药物血清对HCT116细胞凋亡的影响

与空白组、生理盐水组比较，健脾消癌方药物血清干预后，HCT116细胞凋亡比例增加（P<0.01），且呈剂量依赖性。结果见表2、图1。

4.2 健脾消癌方药物血清对HCT116细胞周期的影响

与空白组、生理盐水组比较，健脾消癌方药物血清干预后，HCT116细胞G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低（P<0.05，P<0.01），且呈剂量依赖性。结果见表3。

4.3 健脾消癌方药物血清对HCT116细胞核内β-catenin蛋白表达的影响

与空白组、生理盐水组比较，健脾消癌方中、高剂量组HCT116细胞核内β-catenin蛋白表达明显降低，尤以健脾消癌方高剂量组明显，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表4、图2。

4.4 健脾消癌方药物血清对HCT116细胞c-myc、cyclinD1 mRNA表达的影响

与空白组、生理盐水组比较，健脾消癌方中、高剂量组c-myc mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），健脾消癌方高剂量组cyclinD1 mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表5。

5 讨论

本课题组经长期临床实践，认为虚、毒、瘀并存是结直肠癌的基本病机特点，并以“健脾益气，化瘀解毒”为法创制了防治CRC复发转移的经验方健脾消癌方。该方由人参、白术、灵芝、黄芪、茯苓、薏苡仁等组成，寒温并用，攻补兼施，共奏健脾益气、化瘀解毒之功。

Wnt信号在细胞内有2条通路，即经典Wnt/β-catenin通路和非经典Wnt/β-catenin通路。β-catenin是经典Wnt/β-catenin信号通路中的核心元件，在该信号通路中起关键作用。Wnt蛋白通过影响由结直肠腺瘤性息肉蛋白等组成的降解复合物的磷酸化作用调控胞质内β-catenin的浓度变化，参与Wnt信号通路的激活。

Wnt/β-catenin下游靶基因众多，至今已发现的就达30多种，其中包括细胞周期相关基因cyclin，原癌基因c-myc、Survivin等。而细胞周期蛋白cyclinD1的异常以及原癌基因c-myc的表达，可促进细胞过度增殖，抑制细胞凋亡[7]。

凋亡是导致细胞死亡的生理性调节过程。肿瘤的发生、发展与细胞凋亡进程受阻有着密切联系[8]。因此，可通过观察药物对肿瘤细胞凋亡的影响，研究药物的潜在抗肿瘤机制。

本实验结果显示，与空白组及生理盐水组比较，健脾消癌方各剂量组HCT116细胞凋亡比例增加、G1期细胞比例增加，S期细胞比例降低，且其细胞核内β-catenin蛋白表达降低，c-myc、cyclinD1 mRNA表达降低。提示健脾消癌方可促进HCT116细胞凋亡，且可将细胞阻滞于G1期，其机制可能与调节Wnt/β-catenin信号通路有关。

参考文献：

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[3] 王容容，王其美，蒋益兰，等.健脾消癌方联合化疗治疗晚期转移性结直肠癌的临床研究[J].中华中医药杂志，2016，31（5）：1732-1735.

[4] 王倩，张珊，封国生.Wnt经典信号通路在结直肠癌中的研究进展[J].医学综述，2017，23（5）：907-911.

[5] MUZNY D M， BAINBRIDGE M N， CHANG K. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer[J]. Nature， 2012，487（7407）：330-337.

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[8] 尹丽颖，李凤金，仲丽丽，等.辽东楤木叶总皂苷对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响[J].中国中医药信息杂志，2017，24（6）：49-52.

（收稿日期：2017-11-03）

（修回日期：2017-12-10；编辑：华强）