改进QuEChERS-浓H2SO4净化-气相色谱/质谱联用检测贝类中多溴联苯醚

孙晓杰， 周明莹， 丁海燕， 卢立娜， 邢丽红， 李兆新*, 刘 莹， 吴 薇， 翟毓秀

(1.农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室,中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；2.农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室, 中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；3.青岛市海洋科技成果推广中心，山东青岛 266071)

多溴联苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)是一种溴系阻燃剂，广泛用于电子产品、纺织等工业领域[1]。PBDEs在生产、使用过程中易通过蒸发、渗漏等途径进入环境，因具有亲脂性、持久性和生物累积性，在环境中难降解，属于持久性有机污染物[2]。其中2,4,4′-三溴联苯醚(BDE-28)、2,2′,4,4′-四溴联苯醚(BDE-47)、2,2′,4,4′,5-五溴联苯醚(BDE-99)、2,2′,4,4′,6-五溴联苯醚(BDE-100)、2,2′,4,4′,5,5′-六溴联苯醚(BDE-153)、2,2′,4,4′,5,6′-六溴联苯醚(BDE-154)、2,2′,3,4,4′,5′,6-七溴联苯醚(BDE-183)和十溴联苯醚(BDE-209)8种PBDEs在食品中的污染问题最为严重，称为指示性单体。研究表明，PBDEs 可通过食物链富集，对生物体具有潜在毒性，会导致动物肝脏肿大,影响脑部、生殖器官和神经行为的发育等，另外可能具有内分泌干扰作用[3-4]，受到国内外科学研究者广泛关注[5-6]。因此,建立有效检测食品中PBDEs的方法，对食品安全和人体健康风险评估具有重要意义[7]。

目前针对PBDEs的前处理方法主要有索氏提取法、液-液萃取法等传统方法，以及加速溶剂萃取法和超声波辅助提取法等新型提取方法。但由于生物体等基质复杂，需要结合中性氧化铝，中性硅胶，碱性硅胶，酸性硅胶等多层净化材料或填充柱，才能实现提取液的较好净化[8-10]。本研究选择8种指示性多溴联苯醚BDE-28、BDE-47、BDE-99、BDE-100、BDE-153、BDE-154、BDE-183和BDE-209作为研究对象，采用正己烷-丙酮混合有机溶剂提取，无水Na2SO4干燥、新型油脂净化粉等改进QuEChERS技术，并结合H2SO4氧化净化技术，实现了贝类样品中多溴联苯醚的高效前处理。选用薄液膜、短柱长的DB-5MS毛细管柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)，结合气相色谱/质谱(GC/MS)技术，实现了贝类样品中低溴代及高溴代联苯醚的同时快速定性和定量分析，该方法各组分峰分离度大、峰形较好，灵敏度高。方法已应用于我国实际海水养殖区贝类中多溴联苯醚的风险监测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

6890-5973气/质联用仪(美国，安捷伦公司);Talboys型旋涡混合器(上海安谱科学仪器有限公司)；BT224S分析天平(法国，Sartorius公司)；N-EVAPTM112型氮气吹扫仪(美国，Organomation公司)。

PBDEs混合标准溶液(溶剂为异辛烷)，包括美国环境保护署(EPA)1614草案中优先关注的8种BDE单体：BDE-28、BDE-47、BDE-100、BDE-99、BDE-154、BDE-153、BDE-183和BDE-209。其中BDE-209质量浓度为200 μg/mL，其余单体的质量浓度均为20 μg/mL。混合标准使用液：准确吸取一定量BDE混合标准溶液，用异辛烷稀释配成1 μg/mL(BDE-209为10 μg/mL)的混合溶液，避光4 ℃ 冷藏保存。内标物：2,2′,3,3′,4,4′,5,5′,6,6′-十氯联苯(PCB209)，用异辛烷配制成100 ng/mL。以上药品均购于美国AccuStandard 公司。正己烷、丙酮(色谱纯，Merk公司)，其他试剂皆为分析纯。EMR-Lipid 净化粉(Agilent公司)；层析硅胶(60～200目，上海安谱科学仪器有限公司)；酸化硅胶粉(将层析硅胶与浓H2SO4以质量比2∶1混合均匀，搅拌无块后使用)；中性氧化铝粉(100～200目，美国Sigma-Aldrich公司)。实验用水由Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司制备)。

1.2 样品处理

1.2.1制样贝类去壳，取可食部分，切为不大于0.5×0.5×0.5 cm小块后，均质混匀，置于-18 ℃冰箱中保存，备用。

1.2.2提取将贝类样品取可食部分匀浆，冷冻干燥后用研钵研碎，称取试样5 g(精确到0.01 g)，置于50 mL具塞离心管中，加入内标标准工作液100 μL；同时加入10 mL水，2 g NaCl，20 mL正己烷-丙酮溶液(1∶1)涡旋萃取10 min，4 000 r/min离心5 min，将提取液转移至另一50 mL离心管。再加入10 mL正己烷-丙酮溶液(1∶1，V/V)重复提取一次，合并提取液于同一离心管中。

1.2.3净化(1)分散固相萃取净化:向上述提取液中加入5 g无水Na2SO4，2 g EMR-Lipid 净化粉。涡旋2 min后,4 000 r/min离心5 min，上清液氮气吹干(40 ℃以内)。(2)H2SO4净化：将上述产品进一步净化，1 mL正己烷溶解后转移至5 mL离心管中，加入200 μL浓H2SO4，涡旋离心后(8 000 r/min,5 min)，取上清液至另一5 mL离心管中，加入1 mL2%Na2SO4溶液清洗至无色，取上清液氮气吹干后，0.5 mL正己烷定容，待测。

1.3 仪器条件

GC条件：DB-5MS 色谱柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)；进样口温度：280 ℃；载气：He气，流速1.0 mL/min；升温程序：90 ℃保持1 min，10 ℃/min速率升温至330 ℃，保持5 min；进样量：1 μL。

MS条件：电子轰击源(EI)，选择离子扫描模式(SIM)监测；电离能量为70 eV；接口温度为300 ℃，离子源温度为230 ℃，溶剂延迟时间5 min。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法优化

2.1.1提取方式优化PBDEs类化合物极性较小，实验分别考察了正己烷、丙酮、乙腈以及正己烷-丙酮(1∶1，V/V)四种溶剂的提取效果。结果发现：乙腈对目标物的提取率较高，但引入杂质干扰较大；正己烷对极性较大的多溴联苯醚提取率不理想；而正己烷-丙酮(1∶1，V/V)对整体提取率最好。采用该混合有机溶剂两次提取，8种多溴联苯醚类的提取效率都达到了80%以上。

2.1.2净化方式优化对于水产样品，需要去除类脂质等杂质。本研究通过有机溶剂提取后，经过分散固相萃取和新型油脂吸附剂(EMR-Lipid)净化等QuEChERS技术，结合浓H2SO4氧化净化，能够更好的降低基质干扰。在分散固相萃取过程，先加入无水Na2SO4除去提取液中的水分，然后对比使用酸性硅胶粉、硅胶粉和中性氧化铝粉等复合净化材料与EMR-Lipid 净化粉的效果，发现EMR-Lipid 净化粉效果优于复合净化材料，且不需要提前制备，操作简单。对于杂质较多的样品基质，继续将上述产品用正己烷溶解后，进一步用浓H2SO4氧化除杂，再加入Na2SO4溶液清洗过量的H2SO4，上清液氮气吹干后定容，供气/质联用仪测定。

图1 PBDEs标准溶液的选择离子(SIM)色谱图Fig.1 SIM chromatogram of PBDEs standard solution(BDE-209 concentration was 1.0 μg/mL,the others were 100 ng/mL)

2.2 仪器条件优化

2.2.1色谱条件优化由于8种多溴联苯醚中存在两组同分异构体(BDE-100和BDE-99,BDE-154和BDE-153),它们的定量和定性离子均相同，对于这类异构体要求在色谱上完全分离，否则会影响定量的准确性。为了使目标化合物峰在最短的时间内完全分开，需使用程序升温。此外，高溴代化合物BDE-209等在色谱柱内保留较强，仪器响应较低，通过改变程序升温和进样口、检测器的温度可以调节其响应值。考虑仪器和色谱柱的最大耐受温度，最终设定进样口温度为280 ℃，质谱接口温度为300 ℃。并优化确定了程序升温条件，8种PBDEs得到较好的分离，且峰形对称好。PBDEs标准溶液的选择离子色谱图见图1。

2.2.2质谱条件优化通过全扫描方式(SCAN)在m/z400～1000范围内分析PBDEs 标准溶液，在质谱库中进行定性检索，确定PBDEs各组分的保留时间和分子离子，查看标准质谱图，选择丰度相对较高、相对分子质量较大和干扰较少的碎片离子作为定性和定量的特征目标离子(表1)。8种多溴联苯醚类皆以PCB-209为内标物质，以定量目标离子的峰面积比较，采用内标法定量。

表1 多溴联苯醚相关质谱参数

*Quntification ion.

2.3 检出限、回收率和精密度

在优化实验条件下，用异辛烷配制系列浓度的标准溶液。以每种目标物定量离子的峰面积与其质量浓度作标准曲线。从表2可以看出，8种多溴联苯醚类在对应浓度范围内线性关系良好。本文采用向空白贝类样品中添加标准溶液的方法，得到方法对8种多溴联苯醚类的检出限(LOD，S/N>3)，除BDE-209为1.0 μg/kg，其余为0.1 μg/kg，定量限(LOQ，S/N>10)，除BDE-209为3.0 μg/kg，其余为0.3 μg/kg，回收率在90.0%～120%之间，相对标准偏差(RSD)皆小于10%。说明方法的准确度和灵敏度较高，重现性好，适合于贝类样品中多溴联苯醚类残留的同时检测。

空白和加标样品的选择离子色谱图见图2。

2.4 样品测定

采用本方法分析了来自胶州湾海域的20多个贝类样品。结果表明，样品中皆有不同含量的BDE28、BDE-47、BDE-183被检出，总量范围为0.222～2.46 μg/kg，含量较低，表明此海域受到轻度污染。

表2 贝类样品中多溴联苯醚类添加回收实验(n=6)

图2 空白和贝类加标样品的选择离子(SIM)色谱图 Fig.2 SIM chromatograms of blank(A) and PBDEs spiked shellfish samples(B)BDE-209 concentraion was 50 μg/kg,others were 5.0 μg/kg.

3 结论

本方法实现了贝类样品中低溴代及高溴代联苯醚的同时快速定性和定量分析。样品加标回收率在90.0%～120%之间，相对标准偏差皆小于10%，说明方法的准确性和灵敏度较高，重现性好，且方法操作简便、高效、易于普及，适合于贝类样品中多溴联苯醚类残留的同时检测以及不同海水养殖区贝类中多溴联苯醚类的风险监测。