气相色谱-质谱法测定人体尿液中的对羟苯基乳酸、对羟苯基丙酸和尿黑酸

付红萍， 杨永丽， 刘梦晗， 鄢爱平， 万益群*,

(1.江西省肿瘤医院，江西南昌 330029;检出限及定量限2.南昌大学化学学院，江西南昌 330031;3.南昌大学第二临床医学院，江西南昌330031；4.南昌大学分析测试中心，江西南昌 330047)

根据世界卫生组织(WHO)报道，癌症是引起疾病患者死亡的主要原因之一，并且死亡率每年呈增长趋势[1]。研究表明，癌症如能早期发现，其治愈率可显著提高。自1978年Herberman在美国国立癌症研究所(NCI)召开的人类免疫及肿瘤免疫诊断会上，首次提出肿瘤标志物(Tumor Marker)概念以来，肿瘤标志物的监测已广泛应用于临床，以辨别和追踪肿瘤的存在和变化。目前，肿瘤标志物[2 - 5]的研究已成为一个热点领域，某些特异性标志物有望应用于早期癌症诊断，进而提高某些癌症的治愈率。相关研究表明，氨基酸在人体新陈代谢过程中起着重要的作用，是人体健康状况的重要参数指标，一些癌症患者体内的酪氨酸及其代谢产物的含量较正常人会发生变化[6 - 8]。对羟苯基乳酸(4-Hydroxyphenyllactic Acid,PHPLA)、对羟苯基丙酸(3-4-Hydroxyphenylpropionic Acid,PHPA)以及尿黑酸(2,5-dihydroxyphenylacetic acid,HGA)是酪氨酸的重要代谢产物，因此，研究监测人体体液中PHPLA、PHPA和HGA含量的变化对癌症的诊断和治疗具有重要的现实意义。

目前，关于酪氨酸及其代谢产物的检测方法主要有光度法[9 - 10]、离子交换色谱法[11 - 13]、液相色谱法[14 - 16]以及气相色谱法[17 - 19]。其中，气相色谱法具有分析速度快、灵敏度高和选择性好等特点，是测定酪氨酸及其代谢产物常用的方法之一。采用气相色谱法检测酪氨酸代谢产物的研究中，血清中酪氨酸的代谢产物的研究报道较多，而对尿液中酪氨酸的代谢产物研究报道较少。本文采用气相色谱-质谱联用技术，建立了人体尿液中PHPLA、PHPA以及HGA同时检测的新方法，并应用于实际样品的检测，取得了较为满意的结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890B气相色谱仪(美国,Agilent公司)；Agilent 5977A质谱仪(美国,Agilent公司)；AP210电子天平(美国,Ohaus公司)；MS2迷你振荡器(广州仪科实验室技术有限公司)；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

对羟苯基乳酸(PHPLA,纯度>99%)、对羟苯基丙酸(PHPA,纯度>98%)购自于美国Acros Organics公司；尿黑酸(HGA)购自于东京 Chemical Industry 公司；吡啶(99.8%)购自于美国 Aladdin公司；BSTFA+1%TMCS购自于美国 Sigma-Alorich公司；色谱纯环己烷、乙腈购自于美国TEDIA公司；高纯氦气(纯度>99.999%)；色谱纯甲醇购于美国Tedia公司。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取12.5 mg PHPLA、HGA及PHPA标准品，置于25 mL容量瓶中，用1%的甲醇溶解并定容，摇匀，配制成500 mg/L的标准储备液，置于4 ℃的冰箱内保存。使用时用甲醇稀释至所需浓度。

1.3 色谱及质谱条件

色谱条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：270 ℃；柱温：70 ℃保持5 min，以30 ℃/min升至200 ℃保持2 min,以3 ℃/min升至230 ℃保持2 min；载气：高纯氦气；流速：1.0 mL/min；进样量：2 μL(不分流进样)；溶剂延迟：5 min。

质谱条件：GC-MS接口温度：280 ℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；电子倍增器电压：1 753 V；采集方式：选择离子扫描。PHPLA、PHPA和HGA的保留时间、定量离子以及定性离子如表1所示。

表1 PHPLA、PHPA和HGA的保留时间、定量离子以及定性离子

1.4 尿样的采集与处理

健康人尿样由南昌大学志愿者提供；癌症患者尿样由江西省肿瘤医院提供。采集的尿样于冰箱中冷冻保存。将尿液从冰箱中取出，解冻至室温，混合均匀，以12 000 r/min离心30 min。取上清液1.0 mL，加入1.0 mL乙腈，涡旋1 min，静置10 min，12 000 r/min离心10 min。取上清液1.0 mL，氮气吹干后，加入75 μL吡啶和60 μL BSTFA+1%TMCS，于60 ℃下反应1 h后，加入0.5 mL环己烷，待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离条件的选择

图1 经BSTFA+1%TMCS衍生后的对羟苯基丙酸(PHPA)、尿黑酸(HGA)和对羟苯基乳酸(PHPLA)色谱分离图Fig.1 Chromatogram of PHPA,HGA,PHPLA,after derivation with BSTFA+1%TMCS1.PHPA(3 mg/L);2.HGA(3 mg/L);3.PHPLA(3 mg/L).

尿样成分较为复杂，为使衍生后酪氨酸的代谢产物达到较好的分离效果，本实验采用HP-5MS毛细管色谱柱进行分离，并对升温程序进行了优化：(1)70 ℃保持5 min，以10 ℃/min升至200 ℃保持2 min，5 ℃/min升至230 ℃保持2 min；(2)70 ℃保持5 min，以15 ℃/min升至200 ℃保持2 min，5 ℃/min升至230 ℃保持2 min；(3)70 ℃保持5 min，以30 ℃/min升至200 ℃保持2 min，3 ℃/min升至230 ℃保持2 min；(4)70 ℃保持5 min，以30 ℃/min升至200 ℃保持2 min，2 ℃/min升至230 ℃保持2 min。对比分析衍生后的酪氨酸的代谢产物的分离效果及其相应响应信号，选择第(3)种升温程序作为程序升温条件，三种化合物色谱分离图如图1所示。

2.2 衍生条件的优化

2.2.1衍生剂用量的选择根据文献报道[20 - 21]，本实验选择的衍生剂为BSTFA+1%TMCS。0.5 mL混合标准品(各标准品的浓度均为5 mg/L)氮气吹干后，分别加入40、50、60、70、80、90、100 μL的BSTFA+1%TMCS衍生剂，如图2所示。结果表明，当衍生剂的用量为60 μL时，目标化合物响应信号最强。

2.2.2衍生时间的优化加入60 μL的BSTFA+1%TMCS衍生剂后，在60 ℃烘箱中分别衍生了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，如图3所示。结果表明，当衍生时间为1 h时，目标化合物的峰面积最高。

图2 BSTFA+1%TMCS用量对对羟苯基乳酸(PHPLA)、对羟苯基丙酸(PHPA)和尿黑酸(HGA)的衍生效果的影响Fig.2 Effect of the amount of BSTFA+1%TMCS on the derivatization of PHPLA,PHPA and HGAa：PHPLA；b：PHPA；c：HGA.

图3 衍生化时间对对羟苯基乳酸(PHPLA)、对羟苯基丙酸(PHPA)和尿黑酸(HGA)的衍生效果的影响Fig.3 Effect of derivatization time on the derivatization of PHPLA,PHPA and HGA a:PHPLA;b：PHPA；c：HGA.

图4 衍生化温度对对羟苯基乳酸(PHPLA)、对羟苯基丙酸(PHPA)和尿黑酸(HGA)的衍生效果的影响Fig.4 Effect of derivatization temperature on the derivatization of PHPLA,PHPA and HGAa：PHPLA；b：PHPA；c：HGA.

2.2.3衍生温度的优化加入60 μL BSTFA+1%TMCS衍生剂后，分别在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃的烘箱中衍生1 h，如图4所示。结果表明，当衍生温度为60 ℃时，目标化合物的响应最大。

2.3 样品前处理条件的选择

人体尿液中含有较多蛋白，影响目标物的分析，所以除去尿液中的蛋白很有必要。实验考察了采用脲酶和乙腈去除蛋白的效果。结果表明，当使用脲酶除蛋白时，虽然效果较好，但目标物的响应信号减弱；当使用乙腈除蛋白时，对目标物的信号没有影响，且能满足分析的要求。因此，本实验选择乙腈来除去尿液中的蛋白。

2.4 线性方程、相关系数和检出限

将PHPLA、PHPA以及HGA的储备液配制成一系列不同浓度的混合标准工作溶液，按照所选择的衍生条件进行处理，在已优化的色谱-质谱条件下进行分析，以峰面积(A)对分析物的浓度(c)绘制校准曲线，结果见表2。由表2可见，三种化合物的线性范围均为0.025～3.00 mg/L，线性相关系数在0.9993～0.9995之间。

表2 PHPLA、PHPA和HGA的线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.5 回收率与精密度

为了考察方法的准确性，通过添加三个不同浓度水平的PHPLA、PHPA和HGA进行实验，加标尿样和不加标尿样按照1.4节进行处理，在已优化的色谱条件下进行检测，每个水平平行测定6次，结果如表3所示。回收率在94.5%～110.0%之间，相对标准偏差(RSD)小于3.0%。

表3 健康人尿液中PHPLA、PHPA和HGA的加标回收结果(n=6)

ND:not detected.

2.6 样品的测定

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。在我国许多大城市中，乳腺癌发病率已经上升为女性恶性肿瘤的第一或第二位，死亡率占第四位或第五位，成为妇女健康的最大威胁。研究表明，人体尿液中酪氨酸及其代谢产物的含量与乳腺癌有一定的关联性，但对于PHPLA、PHPA和HGA与乳腺癌的关系则研究较少。本文应用所建立的分析方法，对健康组(No.1～30)和乳腺癌患者组(No.31～36)尿液进行分析。健康人及乳腺癌患者尿液中三种化合物色谱分离图如图5和图6所示。结果如表4所示。

图5 健康人尿液中尿黑酸(HGA)和对羟苯基乳酸(PHPLA)色谱分离图Fig.5 Chromatogram of HGA and PHPLA in urine of healthy human1.HGA,2.PHPLA.

图6 乳腺癌患者尿液中尿黑酸(HGA)和对羟苯基乳酸(PHPLA)色谱分离图Fig.6 Chromatogram of HGA and PHPLA in urine of breast cancer patients1.HGA,2.PHPLA.

SampleHGA(mg/L)PHPA(mg/L)PHPLA(mg/L)SampleHGA(mg/L)PHPA(mg/L)PHPLA(mg/L)10.03ND0.13190.03ND1.5620.03ND0.13200.04ND0.213NDND0.06210.04ND0.0940.03ND0.08220.03ND0.1150.03ND0.13230.03ND0.056NDND0.06240.03ND1.3170.03ND0.15250.04ND0.0680.03ND0.03260.04ND0.4190.03ND0.06270.03ND0.04100.03ND0.04280.04ND0.22110.03ND0.10290.04ND0.23120.03ND0.07300.03ND0.05130.03ND0.0831NDND1.55140.03ND0.0632NDND1.60

(续表4)

SampleHGA(mg/L)PHPA(mg/L)PHPLA(mg/L)SampleHGA(mg/L)PHPA(mg/L)PHPLA(mg/L)150.03ND0.0433NDND2.24160.03ND0.07340.19ND1.55170.03ND0.27350.04ND1.60180.03ND0.1836NDND1.55

ND:not detected.

PHPLA、PHPA和HGA分别在健康人和乳腺癌患者的平均浓度如表5所示，健康人与乳腺癌患者尿液中PHPLA和HGA的T-检验值分别为7.63×10-11和0.15。实验结果表明，乳腺癌患者尿液中PHPLA浓度均明显高于健康人(p<0.01)；乳腺癌患者尿液中HGA浓度与健康人相比无明显差异；健康人和乳腺癌患者尿液中均未检测出PHPA。

表5 不同尿样中PHPLA、PHPA和HGA的平均值(mg/L)

ND:not detected.

3 结论

本实验应用气相色谱-质谱联用技术，研究建立了人体尿液中对羟苯基丙酸、尿黑酸和对羟苯基乳酸的分析新方法。实验优化了衍生条件，在优化的色谱及质谱条件下，取得了良好的分析结果，目标分析物的相关系数在0.9993～0.9995之间，三个不同加标浓度水平下的加标回收率在94.5%～110.0%之间，相对标准偏差小于3.0%。实验数据表明，乳腺癌患者和健康人尿液中对羟苯基乳酸含量有一定的差异性，而尿黑酸则无明显差异，对羟苯基乳酸有可能作为乳腺癌的标志物。