基于SCoT分子标记的裸果木遗传多样性分析

狄林楠 李新蓉 宋 楠

(新疆农业大学草业与环境学科学学院，乌鲁木齐 830052)

遗传多样性作为生物多样性的重要组成部分，是物种多样性和生态系统多样性的基础，是生物物种在长期进化过程中积累起来的遗传变异，是其生存适应和进化的前提，遗传多样性的丧失将对物种生存带来不利影响[1～2]。对珍稀濒危植物的遗传多样性研究不仅有助于了解物种的进化历史和适应潜力，同时对其保护和管理也至关重要[3～4]。近年来，随着DNA分子标记技术的不断完善和发展，包括ISSR、RAPD等DNA分子标记正广泛地应用于珍稀濒危植物遗传多样性的研究[5～7]。目标起始密码子多态性(SCoT,start codon targeted polymorphism)标记是Collard和Mackill[8]基于植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性而新开发的一种目的基因分子标记。与ISSR标记、RAPD标记类似亦为单引物，不同的是SCoT分子标记是一种目的基因分子标记，其本身可能是目的基因的一部分或与目的基因紧密联锁；另外与RAPD标记相比较，其使用了较长的引物长度，理论上比RAPD标记重复性好；同时还具有引物设计简单、操作简单、成本低廉和多态性高等特点[8～10]。目前已成功在评估遗传多样性与遗传结构、种质鉴定与指纹图谱构建等方面得到运用[11～14]。

裸果木(Gymnocarposprzewalskii)为石竹科(Caryophyllaceae)裸果木属(Gymnocarpos)植物，亚灌木，是白垩纪——第三纪古老荒漠的残余成分，是构成石质荒漠植被重要建群物种之一，对研究中国西北荒漠的形成、气候变化以及旱生植物区系成分的起源有较重要的科学价值[15]。裸果木在国内仅分布在甘肃、内蒙古、宁夏和新疆等省区，另有少量分布在蒙古，在新疆主要分布在哈密盆地和塔里木盆地[16～17]。裸果木具两性花，在盛花期呈现出“集中大量”的开花模式，并有少量花蜜分泌且有浓烈气味，繁育系统属于以异交为主、部分自交亲和且需要传粉者的混合繁育系统类型[18～19]。由于裸果木生存条件恶劣，过度樵采和骆驼啃食等人类活动的干扰和破坏，其种群处于不断衰退中[20]。王静等[21]对裸果木RAPD反应体系优化进行了研究，Ma等[22]运用叶绿体DNA和徐振朋等[23]用ISSR标记对裸果木种群遗传多样性进行了研究，但关于裸果木遗传多样性和遗传结构及其影响因素还有所不足，本文运用SCoT分子标记技术对新疆裸果木分布集中的7个自然种群遗传多样性进行分析，探讨裸果木种群遗传多样性和遗传结构及其影响因素，为进一步保护和利用裸果木提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 野外调查和采样

2015年5月在新疆裸果木分布集中的7个自然种群采集样品，材料来源见表1和图1。选取裸果木顶端幼嫩的叶片放入装有硅胶的自封袋中干燥，每个自封袋中硅胶与裸果木嫩叶的比例不小于100∶1，对每袋样本分别进行标记。

表1裸果木自然种群的地理位置和样本大小

Table1LocationsamplesizeofG.przewalskiipopulations

种群Population经度Latitude(E)纬度Longitude(N)海拔Altitude(m)样本数Sample number轮台Luntai(LT)84°24'41°59'107730乌恰Wuqia(WQ)75°01'39°39'213430拜城Baicheng(BC)81°50'41°52'140839疏附Shufu(SF)75°44'39°19'13526库车Kuqa(KC)82°41'41°55'146536哈密庙尔沟Hami Miaoergou(HM)93°53'42°52'97830哈密三道岭Hami Sandaoling(HS)92°33'43°15'132930

图1 裸果木采样分布图Fig.1 Geographic location of G.przewalskii

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取

采用改良CTAB法提取裸果木基因组DNA，所得的DNA用紫外分光光度计(NanoDrop ND1000型，美国Thermo Scientific公司)和1%的琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和质量，并于-80℃保存备用。

1.2.2 引物筛选

SCoT引物参照Collard和Mackill[8]、Luo等人[11]公布的引物序列，由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，引物筛选过程如下：

(1)初筛：选取供试样品中7个种群各一个样品所提取的DNA组成混合模板，分别对80条引物组合进行筛选，以期得到适合裸果木遗传多样性分析的引物(此次筛选结果筛选出28条引物)。

(2)复筛：利用筛选出的引物分别对个体进行筛选，选出最适合于此样品的引物。利用最终确定的引物(表2)对裸果木所有个体进行PCR扩增。

表2 SCoT引物信息表

1.2.3 SCoT-PCR扩增及检测

SCoT-PCR反应体系：25 μL的反应体系中包含有l μL模板DNA(50 ng)，1 μL引物(10 μmol·L-1)，0.3 μL Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)，0.4 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，2.5 μL 10×Taq Buffer(15 mmol·L-1MgCl2)，其余部分由ddH2O补足。

PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性5 s，退火15 s，72℃延伸50 s反应35个循环，72℃延伸7 min，4℃保存。

PCR扩增产物检测：扩增产物与4 μL上样缓冲液混合后在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳1 h分离，利用银染法进行染色，照相记录。

1.2.4 数据处理

根据每条引物扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶中迁移率的不同，对电泳结果进行统计，扩增阳性(有条带出现)赋值为1，扩增阴性(无条带出现)赋值为0，依据条带有无统计得到所有位点的二元矩阵输入计算机。应用Popgene32计算多态位点数(P)、多态位点百分率(PPB)、观察等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、Nei’s遗传多样性指数(H)、Shannon’s信息多样性指数(I)、种群总的基因多样性(Ht)、种群内的基因多样性(Hs)、遗传分化系数(Gst)、Nei的遗传一致度和遗传距离，根据Ht和Hs计算种群间的基因多样性和种群内遗传分化所占比例，种群间基因流(Nm)由Nm=(1-Gst)/4Gst计算。另外运用SPSS20.0软件非参数检验对H和I进行显著性检验，检验各种群间遗传多样性是否存在差异。

采用STRUCTURE2.3.4软件分析裸果木的遗传结构，将参数“Length of Burnin period”和“Number of MCMC Reps after Burnin”均设为10 000次，K值设为2～7，重复次数为10。将运算结果提交到在线工具Structure Harvester(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)以判断群体的最佳K值(△K值)，运用CLUMPP1.1.2重复抽样分析最佳K值，再利用Distruct 1.1软件作图。

运用NTSYS 2.10e软件对裸果木种群遗传距离和地理距离的相关性进行Mantel检验。此外对201份不同自然种群裸果木材料进行主坐标分析(PCoA,principal coordinates analysis)，建立平面散点图。

2 结果

2.1 裸果木种群的遗传多样性

12条引物对7个种群的201个个体共扩增出145个位点，扩增得到的DNA片段长度大多介于100～1 500 bp，每条引物扩增的位点在10～17个。由表3可知，裸果木物种水平的多态位点数为141个，多态位点百分率为97.24%；而种群水平的多态位点数在54～131，多态位点百分率在37.24%～90.34%，疏附(SF)种群的多态位点百分率最低为37.24%，而哈密庙尔沟(HM)种群的多态位点百分率最高为90.34%，种群水平平均多态位点百分率为76.45%。

用Popgene32对不同裸果木自然种群的遗传多样性进行统计分析(表3)，裸果木种群观察等位基因数在1.372 4～1.903 4，有效等位基因数在1.252 9～1.484 2，Nei’s遗传多样性指数在0.145 6～0.285 1，Shannon’s信息多样性指数在0.214 4～0.432 0，其中哈密庙尔沟(HM)裸果木种群在几个遗传多样性指标均高于其它裸果木种群，疏附(SF)种群最低。整体而言，裸果木物种水平上的遗传多样性相对丰富，观察等位基因数、有效等位基因数、Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s信息多样性指数分别为1.972 4、1.436 9、0.263 8和0.408 1；而种群水平上的遗传多样性相对较低，几个遗传多样性指标平均值分别为1.764 5、1.350 4、0.213 7和0.331 6。对裸果木种群的Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s信息多样性指数的显著性检验结果表明：哈密三道岭(HS)分别与哈密庙尔沟(HM)、乌恰(WQ)种群的Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s信息多样性指数差异不显著(P>0.05)，与其它种群存在显著差异(P<0.05)；疏附(SF)与轮台(LT)、拜城(BC)、库车(KC)种群的Nei’s遗传多样性指数差异不显著(P>0.05)，与其它种群存在显著差异(P<0.05)；疏附(SF)与库车(KC)种群的Shannon’s信息多样性指数差异不显著(P>0.05)，与其它种群的差异存在显著差异(P<0.05)。

表3 裸果木自然种群的遗传多样性指标

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)P.多态位点数；PPB.多态位点百分率；na.观测等位基因；ne.有效等位基因数；H. Nei’s遗传多样性指数；I. Shannon’s信息多样性指数

Note:The data with different little letters in same column show significant difference(P<0.05)P. Number of polymorphic loci;PPB. Percentage of polymorphic bands;na. Observed number of alleles;ne. Gene diversity in subdivided populations;H. Nei’s gene diversity;I. Shannon’s information index

2.2 裸果木种群的遗传结构

裸果木总的基因多样性(Ht)为0.261 8，种群内的基因多样性(Hs)占81.61%，为0.213 7，种群间遗传分化系数(Gst)为0.183 9，表明种群间的基因多样性(Ht-Hs)占18.39%，为0.048 1，基于遗传分化系数而得出的基因流(Nm)为1.109 4。从表4可看出，裸果木各种群间的遗传一致度在0.887 9～0.972 7，库车(KC)和哈密三道岭(HS)种群的遗传一致度最小，哈密三道岭(HS)与哈密庙尔沟(HM)种群的遗传一致度最大；裸果木种群间的遗传距离在0.027 7～0.118 9，其中库车(KC)和哈密三道岭(HS)种群的遗传距离最远，哈密三道岭(HS)与哈密庙尔沟(HM)种群的遗传距离最近。Mantel检验结果表明裸果木种群遗传距离与地理距离之间不存在显著相关性(r=0.239 8，P>0.05)。

表4裸果木自然种群间的遗传一致度和遗传距离

Table4GeneticidentityandgeneticdistanceofG.przewalskiipopulations

LTWQBCSFKCHMHSLT****0.96980.96280.89180.90350.93320.9246WQ0.0306****0.97060.91990.92950.94560.9333BC0.03790.0298****0.91310.93050.94380.9318SF0.11460.08350.0909****0.96540.90210.8901KC0.10150.07310.07200.0352****0.90020.8879HM0.06920.05600.05790.10300.1051****0.9727HS0.07840.06900.07060.11640.11890.0277****

注:对角线上方为Nei’s 遗传一致度，对角线下方为遗传距离。

Note:Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance(below diagonal).

为了探讨裸果木个体间的亲缘关系，根据SCoT标记所获得的结果，分别进行主坐标分析和STRUCTURE分析。主坐标分析结果见图2，第1、2主成分分别解释了12.4704%和7.2422%的样本相关性，201株裸果木大致可以被分为3大组：第一组以哈密两个种群为主，第二组以乌恰(WQ)、轮台(LT)和拜城(BC)种群为主，第三组以库车(KC)、疏附(SF)种群为主。STRUCTURE分析表明，当K=5时，ΔK散点曲线出现最大值，出现明显拐点，说明201株裸果木被分为5个组群(图3)。裸果木个体归属于各组群的结果显示：组群1(蓝色)以哈密两个种群为主，组群2(绿色)以轮台(LT)和乌恰(WQ)种群为主，组群3(黄色)以乌恰(WQ)和拜城(BC)为主，组群4(粉红色)以疏附(SF)和库车(KC)为主，组群5(红色)包含库车(KC)、哈密庙尔沟(HM)和哈密三道岭(HS)种群部分裸果木个体(图4)。

图2 裸果木201株个体的主坐标分析图Fig.2 Principal coordinate analysis for 201 individuals of G.przewalskii

图3 Delta K(ΔK)值随组群数的变化图Fig.3 Plot of the Delta K(ΔK) on the number of population genetic clusters

3 讨论

3.1 裸果木的遗传多样性

在物种水平上，裸果木多态位点百分率(PPB)为97.24%，Nei’s遗传多样性指数(H)和Shannon’s信息多样性指数(I)分别为0.263 8和0.408 1，明显高于我国干旱地区孑遗植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus，I=0.102 6)和新疆沙冬青(A.nanus，I=0.070)[24]，与蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)和长叶红砂(Reaumuriatrigyna)[5,25]等曾在第三纪或更早广泛分布的孑遗植物相同，具有较高的遗传多样性。一些研究表明物种遗传多样性的维持与其繁育系统、种子传播机制、生活型、地理分布和系统进化历史有关，其中繁育系统和系统进化历史是影响物种遗传多样性的重要因素[26～27]。裸果木作为第三纪孑遗植物，较长的进化历史所积累的突变，导致其具有丰富的遗传基础，由于其受第四纪冰川作用的影响，现有幸存种群可能保留和继承了了祖先总体丰富的遗传基础，使其具有较高的遗传多样性。在我们前期研究中，发现裸果木具有以异交为主，部分自交亲和，需要传粉者的混合繁育系统类型[18]， 可以通过有性重组产生新的基因型，从而维持其种群的遗传多样性。在种群水平上，裸果木自然种群的遗传多样性指标变化范围较大，具有较高的遗传多样性，Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s信息多样性指数的显著性分析表明，各种群间遗传多样性有较大差异(表3)，这可能与种群大小和人为干扰等因素有关，如疏附种群遗传多样性较低，可能是由于规模较小，部分植株又因修路而被砍伐，所剩个体数量较少，容易引起种群内近交和遗传漂变的发生而导致遗传多样性的丧失。

图4 STRUCTURE对裸果木遗传结构的分析结果Fig.4 Results of genetic structure analyses of G.przewalskii by STRUCTURE

3.2 裸果木的遗传结构

裸果木遗传分化系数为0.183 9，说明其遗传变异主要来自种群内，种群间存在一定程度的分化。裸果木的基因流为1.109 4，表明裸果木种群间存在着一定程度的基因交流，可能是因为异交为主的繁育系统促进了种群个体间的基因交流，这有利于减小其因遗传漂变引起的种群间的分化。一些学者提出，种群间没有完全的地理隔离或空间隔离，存在一定程度基因流[28～29]。本文中裸果木种群地理距离均较远，其中哈密庙尔沟(HM)和哈密三道岭(HS)种群分布在天山东段的哈密盆地，其余种群沿天山南麓不连续地分布在塔里木盆地西部和北部。我们猜测裸果木种群间存在一定的基因交流，但不完全隔离导致其种群间产生了一定程度的分化。

运用主坐标分析(PCoA)和STRUCTURE分析对裸果木个体聚类分析存在一定差异，但总体上结果是一致的。这可能是因为主坐标分析(PCoA)是根据遗传相似系数进行遗传聚类，而STRUCTURE分析是基于模型，以似然值或贝叶斯方法进行群体聚类[30～31]。有关对同种植物采用不同方法进行遗传结构分析而结果不一致的研究也有报道[7,32]。两种聚类分析方法均表明地理距离近的种群不一定优先聚在一起，Mantel检验的结果表明裸果木种群地理距离与遗传距离不存在显著相关性也证明了这一点。这说明除地理隔离外，群体间现有的遗传结构还可能与裸果木的进化历史和各种群的人为破坏程度等因素有关。有研究表明，第四纪冰期和间冰期气候变化反复导致植物在冰期退缩到生境适宜的避难所，冰期后又从避难所迁移扩散到其他地区[33～34]，随着第四纪冰期后气候变暖，拜城(BC)、轮台(LT)和库车(KC)种群可能分别由位于塔里木盆地避难所的乌恰(WQ)和疏附(SF)种群快速扩张形成的。人为干扰也可能会对物种的遗传分化造成一定影响[35]，在野外调查中发现高频繁的人为活动造成部分裸果木种群逐渐缩小，如疏附(SF)种群由于修路导致部分植株被砍伐，可能会降低种群间基因交流强度，加剧遗传分化程度。林乐静等[36]研究认为修路和开荒毁林导致伯乐树(Bretschneiderasinensis)部分种群数量和规模减少，可能会加剧种群遗传分化，李龙梅等[37]发现马褂木(Liriodendronchinense)东部组遗传分化较高，这可能与人为活动频繁致使群体规模剧减有关。

3.3 裸果木的保护

裸果木遭樵采和骆驼啃食严重，暴雨和山洪等自然灾害也会对其产生一定程度的影响，造成裸果木个体数量日趋减少。在前期研究中发现裸果木结实率低，传粉媒介和花粉传播受到限制。裸果木目前虽具有较高的遗传多样性，但随着裸果木有性生殖持续受到限制以及个体数量进一步减少，其遗传多样性很可能会逐渐降低。根据本文的研究结果，建议制定保护措施如下：第一，就地保护，当地政府可以在裸果木遗传多样性高和分布集中的地区(如哈密庙尔沟、哈密三道岭和乌恰)建立自然保护区，严禁乱垦滥伐，就地保护裸果木；第二，迁地保护，在进行迁地保护的过程中应考虑近交衰退和远交衰退的影响[38]，应根据种群聚类结果，有选择性地从不同自然种群引种(如从疏附引种到哈密两个种群)，人为提高种群的基因交流，增强物种进化潜力；第三，在花期对传粉昆虫访问较少的裸果木个体补授花粉，以提高其有性生殖的能力，从而提高其种群内的遗传多样性。