基于cas9/gRNA创制毛果杨PtrFLA31/34突变体

位 珍 程玉祥 夏德安

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室,哈尔滨 150040)

束状阿拉伯半乳聚糖蛋白(fasciclin-like arabinogalactan proteins，FLA)是阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins，AGPs)的一个亚家族，在植物根、茎、种子生长发育中起着重要作用。同时拥有fasciclin结构域和AGP-like糖基化区域的氨基酸特征序列，被认为是FLA家族成员,fasciclin结构域约有110个氨基酸，但其分子功能还不清楚[1]。根据结构域的不同，FLA被分成4个亚类(A-D)，其中A类包含一个fasciclin结构域，其两边有AGP糖基化区域[2]。一些研究表明这个亚类FLA介入植物次生细胞壁功能：杨树PopFLA1-10表达水平被受到的张力及压力调控[3]；拟南芥AtFLA11和AtFLA12参与次生壁沉积[4～6]，AtFLA11/12双突变体茎硬度和韧性均降低且微纤丝角增加[7]；百日菊ZeFLA11特异性表达在其木质部组织[8]；过表达桉树FLA导致转基因植株细胞壁糖含量中木糖和果糖比例发生变化[9]。然而，树木FLA基因敲除的表型，却是值得关注或探究的。

树木遗传杂合度高、多伴进行异交，传统的基因突变方法或策略很难应用于林木，导致无林木纯合突变体应用于其基因功能鉴定。Cas9/gRNA基因组定点编辑技术，通过单链导向RNA(single guide RNA,gRNA)来识别目标DNA序列，引导核酸酶Cas9剪切目标DNA双链、产生核酸编辑[10]，这一技术恰好避开了传统方法制作林木纯合突变体所遇的障碍。目前，Cas9/gRNA已经应用于拟南芥、大豆、烟草、玉米等植物基因组编辑[11～14]，然而模式木本植物—毛果杨中该技术应用还未见报道。

本研究中我们通过生物信息学方法识别毛果杨PtrFLA基因家族，进化树分析表明PtrFLA31和PtrFLA34属于FLA的A亚族，且共同位列在进化树的一个小分支上。基于Cas9/gRNA技术，我们制备出PtrFLA31/34双基因突变体材料，为进一步鉴定该基因功能奠定前提。

1 材料与方法

1.1 试验材料

温室里栽培的3个月的毛果杨(Populustrichocarpa)幼树用于基因表达分析，1个月的无菌组培幼苗用于遗传转化实验。

植物总RNA提取试剂pBIOZOL Reagent(Bioflux)，植物基因组DNA快速提取试剂(Bioteke)，cDNA合成用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser(Takara)，高保真DNA聚合酶为KOD-Plus(Toyobo),胶内DNA采用Silica Bead DNA Gel Extrction Kit(Thermo Scientific)回收。质粒采用E.A.N.A Plasmid Mini Kit(Omega)提取，基因引物合成以及DNA测序由Invitrogen公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 毛果杨PtrFLAs家族成员识别

分别以21个拟南芥FLA家族成员氨基酸序列，在毛果杨基因组数据库Phytozome 12.0中进行同源性检索，并结合fasciclin和fasciclin-like关键词检索，去除重复基因后对所有潜在的FLA成员用SMART[15]确认存在fasciclin结构域(SM00554)。对识别出的FLA家族成员，用SignalP 4.1[16]预测成员N端是否有信号肽，手动分析AGP-like糖基化区域。用MEGA软件构建拟南芥和毛果杨FLA家族成员的进化树。

1.2.2植物总RNA分离、总cDNA合成和基因组DNA提取

各个组织茎节的总RNA提取参照试剂盒提取步骤进行，植物总RNA用反转录试剂盒进一步合成cDNA，基因组DNA提取采用一步法提取。

1.2.3 植物靶基因编辑载体构建

用高保真DNA聚合酶KOD-plus扩增PtrFLA31/34靶位点的gRNA片段，片段胶内回收后在核酸内切酶BsaⅠ和高浓度DNA连接酶作用下，连接到植物基因编辑载体pHSE401[17]。连接产物转入大肠杆菌DH5α，经Kana抗性筛选后得到含pHSE401-gRNA重组质粒菌液，DNA测序确认重组质粒正确。提取质粒后转入GV3101农杆菌，用于毛果杨遗传转化实验。

1.2.4 毛果杨遗传转化及转基因植株鉴定

取25～35 d生长状况良好的毛果杨作为遗传转化材料，采用农杆菌介导法进行毛果杨转基因[18]。取转基因植株的少量叶片，提取基因组DNA后用作模板，用DT1-F0/DT2-R0和zCas-U/D引物进行PCR扩增鉴定转入的gRNA和Cas9基因。

1.2.5 转基因植株体内靶基因位点编辑鉴定

取转基因植株基因组DNA作模板，以FLA31-U/D及FLA34-U/D引物，进行覆盖靶位点片段的PCR扩增。片段从胶内回收后连接到pMD18-T载体，将连接产物取3 μL转入DH5α大肠杆菌，氨苄抗性筛选获得阳性菌液进行插入DNA的测序。与野生型比对测序结果，统计靶基因位点编辑情况，所用引物及序列(表1)。

表1 所用引物及序列

表2 毛果杨FLA家族成员

图1 毛果杨和拟南芥FLA基因进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of FLAs from Arabidopsis thaliana and P.trichocarpa

2 结果与分析

2.1 杨树FLA家族识别

用生物信息学方法我们从毛果杨基因组上鉴定出46个FLA家族成员(表2)，命名为PtrFLA1到PtrFLA46。在这46个PtrFLA家族成员中，其推测氨基酸长度从214到466个。39个PtrFLA成员预测有信号肽，38个成员有1个Fas结构域，8个成员有2个Fas结构域。

为了分析PtrFLA家族成员的同源关系，构建了21个拟南芥AtFLA和46个毛果杨PtrFLA进化树(图1)。进化树表明毛果杨FLA家族成员分处在4个亚类上(A、B、C和D)，其中A亚类包含了毛果杨FLA家族的大多数成员(27个)，比另外3个亚类(分别为6、6、7个)的总数还多。此外，拟南芥A亚类FLA却只有6个成员，暗示这些基因可能参与木本植物高度发达的次生生长相关。

2.2 PtrFLA31和PtrFLA34基因组织转录表达

提取野生型毛果杨木质部、韧皮部、根、顶芽、叶柄、幼叶、老叶以及第1至10茎节的总RNA，经反转录合成了总cDNA。在用Actin2内标基因对各组织总cDNA定量后，PtrFLA31和PtrFLA34基因半定量RT-PCR结果表明，PtrFLA31和PtrFLA34均在木质部高丰度转录表达，在韧皮部也有一定量的表达水平，而根、顶芽、叶柄、幼叶和老叶内几乎不表达(图2)。此外，第1、2茎节中PtrFLA31和PtrFLA34转录量极低，从第3至6节转录量表达逐渐增加，第7至10节维持在较高的表达水平(图2)。

图2 PtrFLA31和PtrFLA34的组织表达分析 1～10. 第1～10茎间Fig.2 Analysis of PtrFLA31 and PtrFLA34 gene expression in Populus 1-10. Internodes 1-10

2.3 PtrFLA3/34基因Cas9/gRNA载体构建

PtrFLA31和PtrFLA34在进化树的一个小分支，且两者氨基酸序列一致性达86.9%，显示这两个基因功能可能存在冗余。为了鉴定其敲除的功能，我们采用Cas9/gRNA编辑技术敲除PtrFLA31/34基因。先设计2个PtrFLA31/34基因特异靶位点的gRNA(图3a)，T1-PtrFLA31/34(gRNA)针对PtrFLA31/34基因，而T1-PtrFLA34(gRNA)仅针对PtrFLA34。经PCR扩增出含这2个gRNA的片段，在酶切后连接到植物基因编辑载体pHSE401(图3b)。将构建的pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)载体进行DNA测序，确认Cas9/gRNA载体构建成功。

图3 pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)载体构建 a.靶点位置及序列；b.CRISPR/Cas9植物基因编辑载体Fig.3 Construction of pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)a. Position and sequence of target site； b. Physical map of CRISPR/Cas9 vectors

2.4 pHSE401-PtrFLA3/34(gRNA)转基因杨树及分子鉴定

选择生长至一个月的无菌组培幼苗(图4a①)，切取第2至4茎节成1 cm茎段，农杆菌侵染转化后茎段暗室培养48 h(图4a②)，脱菌清洗后放入选择培养基(图4a③)，培养30 d后愈伤组织分化出抗性芽(图4a④)，转移到生根培养基继续培养(图4a⑤)，等抗性芽长至3～5 cm盆栽到土壤中(图4a⑥)。实验得到3棵转基因植株(L1、L2和L3)，分别提取这三棵转基因植株基因组DNA，PCR扩增Cas9和gRNA这2个目标基因，结果表明该基因已经转入到毛果杨基因组上(图4b)。

图4 转pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)基因杨树制备及分子鉴定 a.杨树转基因过程简图：①毛果杨无菌组培幼苗；②转化后48 h共培养茎段；③转化后筛选培养基的茎段；④长出转基因抗性芽的茎段(箭头所示)；⑤抗性植株的生根；⑥转基因植株盆栽 b.转基因植株分子鉴定Fig.4 Transformation of pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA) in Populus and its molecular determination a. Transgenic process of pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA) in Populus: ①Young plantlets of tissue culture; ②Cocultured stem segments after transformation; ③The stem segments in selective medium; ④Hygromycin-resistant shoots(arrows); ⑤Hygromycin-resistant plants on rooting medium; ⑥Transgenic plants on soil b.Molecular determination of transgenic plants

图5 PtrFLA31/34基因编辑分析 a.PtrFLA31和PtrFLA34的编辑情况；b.PtrFLA31和PtrFLA34基因编辑后推测氨基酸Fig.5 Analysis of PtrFLA31/34 gene editing in transgenic Populus a. PtrFLA31 and PtrFLA34 gene editing identified from the cloned PCR fragments; b. The presumed amino acids of PtrFLA31 and PtrFLA34 after editing

2.5 PtrFLA31/34基因靶位点编辑分析

PtrFLA31/34基因位点编辑结果如图5a所示，对于T1-PtrFLA31/34(gRNA)，L1和L3转基因植株PtrFLA31基因靶位点被编辑、减少1个T碱基，L2中PtrFLA31靶位点减少2个T碱基。PtrFLA34靶位点在L1和L2中也被编辑减少1个T碱基，而L3中PtrFLA34呈现双等位编辑，分别增加和减少1个T。对于T2-PtrFLA34(gRNA)，L1和L2植株体内PtrFLA34靶位点分别被减少199和20个碱基，而L3植株体内PtrFLA34靶位点未被编辑。分析PtrFLA31/34基因两个靶位点编辑后的序列，推测其氨基酸结果如图5b所示，因移码而产生目标基因编码的终止子提前出现，导致了L1、L2和L3体内PtrFLA31和PtrFLA34均被敲除，形成了fla31/34双基因突变体。

3 讨论

随着植物基因组资源增多，多个植物FLA基因家族被识别报道，如：拟南芥、水稻和棉花分别有21、24和19个FLA基因[2,19～20]。我们从毛果杨中识别出46个PtrFLA基因(表1)，基因数量明显比已报道的草本植物FLA的多，这暗示林木FLA基因家族产生了显著扩张。FLA是植物细胞壁的成分蛋白，这种基因数量的扩张很可能是满足树木从草本进化成木本植物的需要，因为树木进化出高度发达的次生壁组织。我们进化树分析进一步表明毛果杨FLA家族成员同样分为4个亚类(图1)，与草本植物FLA分类相同。然而，引人关注是PtrFLA家族A亚类包含27个基因，约占据其整个家族成员的一半，这种基因扩张可能与毛果杨某种生长性状(例如发达的次生壁组织)密不可分。

FLA作为一种植物细胞壁蛋白参与植物细胞伸长、感应外界环境因子信号等，而AtFLA11和AtFLA12已被报道与植物次生壁形成相关[7]。在本研究中我们通过基因转录表达分析确定，PtrFLA31和PtrFLA34主要在毛果杨次生生长发达的组织内高丰度表达，如茎节和木质部(图2)，这个结果提示此亚类FLA成员很可能参与杨树木材的生长和发育。有一个研究报道，在桉树FLA家族中A亚类的3个成员EniFLA1/2/3也在木质部高丰度表达[6]。然而，PtrFLA31和PtrFLA34在木材形成上的功能，需要利用其突变体来准确鉴定。

Cas9/gRNA植物基因组编辑技术已应用在多个植物物种，包括：拟南芥、大豆、烟草、玉米等[11～14]，对林木物种来说，非常适合应用Cas9/gRNA基因编辑技术帮助鉴定其基因功能和辅助分子育种，然而这方面的研究报道甚少。本研究中我们创建模式树毛果杨的Cas9/gRNA基因编辑技术体系，尝试并实现了对毛果杨PtrFLA31和PtrFLA34双基因同时编辑(图5)。编辑后的PtrFLA31和PtrFLA34基因序列产生终止子提前，形成这两基因被敲除的双突变体。Cas9/gRNA技术在毛果杨中被有效的建立，解决了用传统方法几乎很难制作林木基因突变体的困境，这个技术将加速林木功能基因组鉴定的进展。此外，我们获得的3株毛果杨fla31/34敲除突变体，为下一步深入研究PtrFLA31和PtrFLA34基因功能提供了遗传材料。