肿瘤浸润性树突状细胞和血管内皮生长因子在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

杨会杰，任少达，郭瑞娜， 魏民，李修顺，李鸿超，李莹

(1.濮阳市油田总医院病理科，河南 濮阳 457001；2.聊城市人民医院呼吸科，山东 聊城 252002)

肺癌早期可经血液、淋巴结、直接扩散等方式转移，肿瘤细胞的快速生长和转移是导致患者预后不良的主要危险因素[1-2]。据报道仅2012年全球范围就有1 820 000新发的肺癌患者，其中1 590 000例死亡，肺癌患者5年生存率仅有2%～30%[3]。最常见的肺癌类型为非小细胞肺癌，与小细胞肺癌相比，其分裂和扩散较慢，但由于确诊时患者往往处于中晚期，因此5年生存率非常低[4-5]。目前研究已证实肺癌细胞的快速生长和转移与免疫抑制有关[6-7]。Li等[8]研究表明调节性T细胞与非小细胞肺癌有关，其水平升高可能与免疫的耐受有关，降低其水平或许可改善非小细胞肺癌患者预后。树突状细胞是机体的一种抗原呈递细胞，其功能最大，在肿瘤患者中，主要将肿瘤细胞表面分子标志物和代谢产物等呈递给细胞毒性T细胞等，进而杀伤肿瘤细胞[9-10]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在肿瘤细胞中的高表达同样可以促进肿瘤的转移。然而目前关于肿瘤浸润性树突状细胞(tumor infiltrating dendritic cells，TIDC)和VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达水平尚不清楚。本研究对非小细胞肺癌组织和健康组织中TIDC和VEGF表达水平进行检测，探讨其与非小细胞肺癌的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料自2014年1月至2016年12月，连续性收集濮阳市油田总医院收治的非小细胞肺癌患者106例，纳入标准：(1)非小细胞肺癌(均有病理确诊)；(2)行手术切除可以获得肿瘤标本；(3)年龄18～75岁；(4)同意参与本研究。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)肺癌复发；(3)小细胞肺癌；(4)术前曾接受放疗、化疗或分子生物治疗；(5)6个月内曾接受免疫调节剂；(6)溃疡性结肠炎等免疫系统疾病；(7)急性或慢性感染期；(8)肝肾等脏器功能不全；(9)既往心肌梗死、脑出血等重大心血管疾病。所有患者对本研究均知情同意并签署知情同意书，本研究通过濮阳市油田总医院伦理委员会批准。

1.2研究方法入院后完善相关检验检查，择期行“肺癌切除术”，术中取肿瘤组织，检测肿瘤组织中(据肿瘤边缘1 cm以上的肿瘤组织)和周围健康组织中TIDC(距肿瘤边缘3 cm以上的正常组织)和VEGF水平。并收集患者性别、年龄、临床TNM分期、肿瘤细胞分化程度、病理类型等临床特征，分析TIDC和VEGF与非小细胞肺癌患者临床特征的相关性。

1.3检测方法

1.3.1VEGF和TIDC检测方法 均为免疫组织化学染色，其中TIDC采用S-100兔抗人多克隆抗体标记，VEGF采用VEGF兔抗人多克隆抗体标记(试剂均购买自北京中杉生物技术有限公司)，采用SABC法检测，具体操作步骤见说明书。结果判读(1)TIDC：行免疫组织化学染色，400倍镜下对TIDC细胞计数，随机抽取5个视野，其均值作为该患者的TIDC数密度；(2)染色结果为淡黄色或棕黄色为VEGF阳性，否则为阴性。本研究中非小细胞肺癌组织中TIDC和VEGF表达图片资料见图1。

1.3.2TIDC细胞的MHC-Ⅱ和CD54表型测定 取检测的组织脱蜡、水化后，使用胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min，过滤后离心(800 r·min-1)，去除细胞碎片，沉淀细胞PBS重悬，取106个细胞，离心后去掉上清液，分别加入MHC-Ⅱ和CD54APC抗体(试剂均购买自北京中杉生物技术有限公司)，加入固定液进行流式细胞仪检测(BD FACSAriaⅡ分选型流式细胞仪)。

1.4统计学方法采用SPSS 22.0软件完成数据分析。两组患者TIDC数密度等计量资料之间差异采用两独立样本的t检验进行统计分析；两组患者VEGF阳性率差异采用χ2检验进行统计分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1非小细胞肺癌患者肿瘤组织中和健康组织TIDC和VEGF表达比较与健康组织比较，肿瘤组织中TIDC数密度显著降低[(10.58±3.18)比(18.93±3.26)，P=0.000]；VEGF阳性率显著增高(43.45%比11.32%，P=0.000)；MHC-Ⅱ阳性DC显著降低[(6.48±1.04)%比(12.57±2.57)%，P=0.000]；CD54阳性DC显著降低[(7.12±1.59)比(12.81±2.81) %，P=0.000]。见表1。

2.2非小细胞肺癌患者年龄与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系年龄≥65岁的患者与其他患者相比，TIDC数密度、VEGF阳性率、MHC-Ⅱ阳性DC和CD54阳性DC比均差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3非小细胞肺癌患者性别与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系男性与女性患者TIDC数密度、VEGF阳性率、MHC-Ⅱ阳性DC和CD54阳性DC比均差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4非小细胞肺癌患者临床TNM分期与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系与TNM分期为Ⅰ或Ⅱ期的患者相比，Ⅲ或Ⅳ期患者TIDC数密度显著降低[(9.51±2.88)比(11.82±3.58)，P=0.000]；VEGF阳性率显著增加(61.40%比20.41%，P=0.000)；MHC-Ⅱ阳性DC显著降低[(7.83±1.05)%比(5.32±0.91) %，P=0.000]；CD54阳性DC显著降低[(6.26±1.01)%比(8.12±1.72)%，P=0.000]。见表4。

2.5非小细胞肺癌患者肿瘤细胞分化程度与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系与肿瘤细胞为高分化的患者相比，中低分化的患者TIDC数密度显著降低[(9.58±2.58)比(12.37±3.13)，P=0.000]；MHC-Ⅱ阳性DC显著降低[(6.01±1.09)%比(7.32±0.93)%，P=0.000)；CD54阳性DC显著降低[(6.66±1.68)%比(7.94±1.58)%，P=0.000]。见表5。

表1 非小细胞肺癌患者肿瘤组织中和VEGF表达比较

表2 非小细胞肺癌患者年龄与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系

表3 非小细胞肺癌患者性别与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系

表4 非小细胞肺癌患者临床TNM分期与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系

表5 非小细胞肺癌患者肿瘤细胞分化程度与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系

表6 非小细胞肺癌患者肿瘤病理类型与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系

2.6非小细胞肺癌患者肿瘤病理类型与肿瘤组织中TIDC和VEGF关系腺癌与鳞癌患者TIDC数密度、VEGF阳性率、MHC-Ⅱ阳性DC和CD54阳性DC比较均差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

3 讨论

非小细胞肺癌是肺癌的主要类型，是导致中老年患者死亡的重要原因之一[11]。肺癌的发生、发展与机体免疫相关，近些年肿瘤免疫学的发展为肿瘤的治疗提供了新方向。树突状细胞在肿瘤患者可以作为一种抗原呈递细胞，刺激细胞毒性T细胞等的增殖，进而对肿瘤细胞进行杀伤。而DC细胞在特定环境下可以表现为免疫抑制作用，这部分DC细胞是不成熟或分化异常的DC细胞组成，主要表现为MHC-Ⅱ和CD54阳性率低下[12-14]。然而目前关于DC细胞及其表型在非小细胞肺癌患者中的表达尚不清楚。为此我们设计了本研究，结果显示肿瘤组织中TIDC数密度、CD54阳性和MHC-Ⅱ阳性率均显著低于正常组织(P<0.05)，表明非小细胞肺癌患者肿瘤组织中DC细胞低表达，且以不成熟的DC细胞为主，由于DC细胞是人体最强大的抗原呈递细胞，肿瘤环境中DC水平的降低，可导致机体对肿瘤特异性细胞毒性T细胞的增生促进作用下降，最终导致机体对肿瘤细胞的杀伤作用降低[15-16]。另外，不成熟或分化异常的DC细胞，具有免疫抑制作用，可以分泌不同的细胞因子促进T细胞免疫由Th1免疫向Th2免疫漂移，介导肿瘤细胞对机体的免疫耐受[17-18]。因此肿瘤组织中DC细胞数量降低与不成熟或异常分化，可能会导致患者预后不良，可惜目前相关研究缺乏。本研究显示TNM分期为Ⅲ或Ⅳ期、肿瘤细胞分化程度为低分化的患者肿瘤组织中TIDC数密度、CD54阳性和MHC-Ⅱ阳性率也同样低于其余非小细胞肺癌患者(P<0.05)。DC细胞疗法可能有助于改善非小细胞肺癌患者临床预后。Zhou等[19]研究显示化疗联合DC细胞可以增强对非小细胞肺癌患者肿瘤细胞的杀伤作用。Liu等[20]研究则显示钙网织蛋白可以通过促进DC细胞的成熟和增殖，进而促进抗原特异性细胞毒性T细胞对非小细胞肺癌的杀伤作用。Zhu等[21]研究则显示DC联合放疗可以明显改善ⅢB期非小细胞肺癌患者的临床治疗有效率。但是目前相关研究较为缺乏，尚不能作为依据指导临床治疗，急需大样本量的多中心随机对照研究证实。另外，本研究显示非小细胞肺癌患者肿瘤组织中VEGF阳性率增高，且TNM分期为Ⅲ或Ⅳ期的患者VEGF阳性率高于Ⅰ或Ⅱ期患者(P<0.05)，VEGF是肿瘤血管生成的重要促成因子，肿瘤组织中VEGF高表达可以促进肿瘤血管的生成，进而促进肿瘤细胞的生长和转移[22-24]。

综上所述，TIDC在肿瘤组织中低表达，且多为不成熟的调节性DC细胞，VEGF在肿瘤组织中高表达，均与患者临床预后恶化有关。

(本文图1见插图9-2)