槲皮素-丙酮醛加合产物抗氧化性及抗蛋白糖基化活性

卢永翎，刘贵梅，李 普，侯 玉，吕丽爽*

丙酮醛（methyglyoxal，MGO）、乙二醛（glyoxal，GO）等1,2-二羰基化合物是美拉德反应过程中产生的高活性中间产物，能进一步与氨基酸、肽以及蛋白质的游离氨基酸形成一系列不可逆转、稳定的晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）。1,2-二羰基化合物和AGEs均具有一定毒性，会导致线粒体功能紊乱[1]、抑制DNA的合成[2]、改变内皮细胞形态[3]，引发糖尿病以及糖尿病并发症[4-5]、阿兹海默症和白内障等疾病[6-8]。食品加工过程（如加热[9]、烘烤[10]、油炸[11]）及室温贮藏[12]过程中美拉德反应是外源性1,2-二羰基化合物的主要来源，其反应活性与氨基酸、蛋白质种类相关。油脂氧化过程也会产生包括MGO和GO的醛、酮、酸等小分子物质[13]。在人体内部，蛋白质糖基化反应、磷酸丙糖的降解[14]、细胞的糖降解[15]、苏氨酸降解的酮糖代谢[16]等途径均能产生MGO和GO。研究天然产物抑制体内、外MGO、GO的形成及作用机制是食品和医学领域共同关注的热点。槲皮素是黄酮醇类化合物的典型代表，广泛分布于不同的水果和蔬菜中，具有抗氧化等多种药理活性[17]。

前期研究证明，生理条件下槲皮素通过捕获MGO、GO在A环的C-6或（和）C-8上形成相应的单加合或二加合产物，从而抑制AGEs的形成[17-18]。而在美拉德反应的不同阶段，槲皮素的作用机制有待进一步论证。槲皮素捕获MGO形成的加合物发生在A环，而B环的邻位羟基没有变化，据文献[19]报道槲皮素B环羟基的抗氧化活性最强，推测加合产物可能依然具有抗氧化活性，从而在美拉德反应后期持续发挥抗氧化和抗AGEs功效。为验证此功效，本研究采用槲皮素与MGO反应制备得到单加合和二加合产物（图1），进而对加合产物的总还原能力、油脂抗氧化能力进行检测；并运用气相色谱法及荧光光谱法考察了加合产物在高温油脂体系，加工条件下卵白蛋白-葡萄糖体系，以及生理条件下牛血清白蛋白-葡萄糖体系中，抑制MGO、GO和AGEs的活性。为研究槲皮素及其加合产物在美拉德反应中抑制蛋白糖基化的作用机制和途径提供理论基础。

图1 MM-1（A）和DM-2（B）的结构图Fig. 1 Structures of mono-MGO (MM-1) (A) and di-MGO (DM-2) (B)quercetin adducts

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪油为新鲜猪板油熬制。

槲皮素与MGO形成的单加合产物MM-1（HPLC，纯度≥90%）及二加合产物DM-2（HPLC，纯度≥90%）由实验室自制；槲皮素（HPLC，纯度≥98%）、MGO（质量分数40%水溶液）、GO（质量分数40%水溶液）、邻苯二胺、卵白蛋白 美国Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白（BR级） 上海国药集团化学试剂有限公司；丁基羟基茴香醚（butyl hydroxylanisole，BHA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、无水乙醇、二氯甲烷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙醛、2,3-丁二酮、VC均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

7820A气相色谱仪 美国Agilent公司；Infinite 200 Pro酶标仪 瑞士Tecan公司；743 Rancimat油脂氧化仪 瑞士Metrohm公司；UV-6100A紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；Biofuge Stratos离心机 美国赛默飞世尔公司；CentriVap离心浓缩仪美国Labconco公司；AUY220分析天平 日本岛津公司；DK-S26型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；HH-S恒温油浴锅 金坛市医疗仪器厂；PHS-3C数字式pH计 上海三信仪表厂；KH-300DE超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；XW-80A微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 槲皮素主要加合产物制备

参见本实验室方法[20]制备槲皮素的加合产物，将槲皮素与MGO按物质的量浓度比1∶10在pH 7.4、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）中40 ℃反应48 h，再通过Sephadex LH-20凝胶层析柱分离得到槲皮素与MGO的加合产物MM-1和DM-2。

1.3.2 槲皮素加合产物总还原能力的测定

参考文献[21]的方法，分别取不同浓度的MM-1（或DM-2、槲皮素）的甲醇溶液1 mL与0.2 mol/L、pH 6.6的PBS 2.5 mL和1 g/100 mL铁氰化钾溶液2.5 mL混合均匀，50 ℃水浴保温20 min，加入10 g/100 mL三氯乙酸2.5 mL终止反应，摇匀，10 000 r/min离心10 min，吸取上清液5.0 mL，加入蒸馏水5.0 mL和0.1 g/100 mL的三氯化铁溶液1 mL，混匀静置10 min，以甲醇为空白于700 nm波长处测定吸光度。以吸光度表示还原能力，用对应浓度的VC为阳性对照。

1.3.3 槲皮素加合产物油脂抗氧化能力的测定

参考文献[22]的方法，分别准确称取5 份新鲜的自制猪油5.0 g置于5 个反应池中，再分别添加MM-1、DM-2、槲皮素、BHA（对照）使其最终浓度均为1.0 mmol/L，一份作为空白对照，超声溶解10 min。设置空气流速20 L/h，温度120 ℃，使用油脂氧化仪测定猪油的诱导时间。

1.3.4 槲皮素加合产物对油脂中MGO、GO形成的影响

称取5.0 g玉米油于反应管中，添加MM-1（或DM-2、槲皮素），使其终浓度分别为0.1、0.5、1.0 mmol/L，超声溶解10 min；量取50 mL纯净水于测量池中。设定油脂氧化仪在170 ℃，空气流速20 L/h条件下进行加热反应，收集1 h测量池反应液30 mL置于－80 ℃冷冻备用。样品液解冻混匀后，取1 mL参照本实验室方法[17]，以邻苯二胺为衍生化试剂，2,3-丁二酮为内标，气相色谱法检测样品中MGO、GO并计算抑制率。

1.3.5 槲皮素加合产物对高温条件下卵白蛋白-葡萄糖体系中MGO、GO和AGEs形成的影响

取6 支样品管分别加入8 mg/mL卵白蛋白溶液（50 mmol/L，pH 8.0的PBS配制）2.5 mL和80 mg/mL葡萄糖溶液（50 mmol/L，pH 8.0的PBS配制）1.25 mL，再加入PBS使其最终体积为5 mL，旋涡混匀，置于110 ℃油浴加热0、10、20、30、45、60 min，冷却后于－80 ℃冷冻备用。样品液解冻后加入2 倍体积甲醇除蛋白，13 000 r/min离心30 min，取上清液3 mL参照本实验室方法[17]，测定MGO、GO的含量。样品液解冻后混匀离心（15 000 r/min，20 min），取上清液用酶标仪测定Ex/Em为340 nm/465 nm处相对荧光值。

按上述方法制备卵白蛋白-葡萄糖溶液体系，再分别加入MM-1（或DM-2、槲皮素）溶液，使其最终体积为5 mL，MM-1（或DM-2、槲皮素）最终浓度为0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L。旋涡混匀，置于110 ℃油浴加热30 min，冷却后于－80 ℃冷冻备用。按上述方法测定MGO、GO及荧光性AGEs，以PBS代替槲皮素及其加合产物作为对照计算抑制率。

1.3.6 槲皮素加合产物对生理条件下牛血清白蛋白-葡萄糖体系中MGO、GO和AGEs形成的影响

参照文献[23]方法，取11 支样品管依次加入0.2 mL青霉素和链霉素的混合液，4.5 mg/mL牛血清白蛋白溶液（0.2 mol/L，pH 7.4的PBS配制）2 mL和10 mmol/L葡萄糖溶液（0.2 mol/L，pH 7.4的PBS配制）1.25 mL，再加入PBS使其最终体积为6 mL，旋涡混匀，置于37 ℃水浴加热0、2、6、12、24、72、144、192、288、432、720 h，冷却后于－80 ℃冷冻备用。样品液解冻后加入2 倍体积甲醇除蛋白，离心（13 000 r/min，30 min）取上清液3 mL参照本实验室方法[17]，测定MGO、GO的含量。样品液解冻后混匀，15 000 r/min离心20 min，取上清液用酶标仪测定Ex/Em为340 nm/465 nm处相对荧光值。

按上述方法制备牛血清白蛋白-葡萄糖溶液体系，再分别加入MM-1（或DM-2、槲皮素）溶液，使其最终体积为6 mL，MM-1（或DM-2、槲皮素）最终浓度为0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L。旋涡混匀，置于37 ℃水浴加热288 h，冷却后于-80 ℃冷冻备用。按上述方法测定MGO、GO及荧光性AGEs，以PBS代替槲皮素及其加合产物作为对照计算抑制率。

1.4 数据分析

所有实验均进行3 次重复，数据以 ±s表示；采用Excel 2010、SPSS 17.0分析实验数据。

2 结果与分析

2.1 槲皮素及加合产物的总还原能力

图2 MM-1、DM-2和槲皮素还原能力的测定Fig. 2 Concentration dependence of reducing power of mono-MGO(MM-1) and di-MGO (DM-2) quercetin adducts and quercetin

由图2可知，MM-1、DM-2、槲皮素的还原能力随其浓度的升高呈现明显的量效关系，且差异性显著（P＜0.05）。在低浓度0.005 mmol/L时，DM-2、MM-1的活性要高于槲皮素。当添加浓度为0.05 mmol/L时，槲皮素的还原性要远高于VC，MM-1的还原性略高于VC，而DM-2低于VC。可见槲皮素的加合产物有较好的还原性，3 种物质的还原性在高浓度（0.05 mmol/L）存在明显差异性（P＜0.05），分析原因可能是槲皮素的A环捕获MGO分子后供电子效应及空间位阻的共同影响，其作用机制有待进一步研究。

2.2 槲皮素及加合产物的抗油脂氧化能力

图3 MM-1、DM-2和槲皮素对猪油诱导时间的影响（1.0 mmol/L）Fig. 3 Effect of mono-MGO (MM-1) and di-MGO (DM-2) quercetin adducts and quercetin on the oxidation induction time of lard (1.0 mmol/L)

表1 猪油添加不同抑制剂诱导时间的变化Table 1 Change in oxidation induction time of lard with different antioxidants added

由图3及表1可知，当MM-1、DM-2、槲皮素添加浓度为1.0 mmol/L时，均能显著提高猪油的氧化稳定性，且三者的诱导时间存在显著性差异（P＜0.05）。槲皮素对猪油抗氧化性能最好，其诱导时间是空白组的7.8 倍，优于对照品BHA；MM-1和DM-2的诱导时间分别是空白组的3.8 倍和2.3 倍。可见槲皮素与MGO形成加合产物后依然具有一定的油脂抗氧化活性。

2.3 槲皮素加合产物对高温条件下对玉米油中MGO、GO形成的影响

图4 MM-1、DM-2和槲皮素对玉米油（170 ℃、1 h）中MGO（A）、GO（B）抑制率的影响Fig. 4 Mono-MGO (MM-1) and di-MGO (DM-2) quercetin adducts and quercetin inhibited the formation of MGO (A) and GO (B) in a dosedependent manner during heat treatment of corn oil (170 ℃, 1 h)

由图4可知，在170 ℃条件下将MM-1、DM-2、槲皮素添加入玉米油中加热1 h，3 种物质对MGO和GO的抑制率均随添加量的增大而提高（除MM-1添加量为1.0 mmol/L时对MGO的抑制率略低于0.5 mmol/L）。在低浓度（0.1 mmol/L）时，MM-1对MGO的抑制率略高于槲皮素；当大于等于0.5 mmol/L时，对MGO和GO的抑制率均为槲皮素＞MM-1＞DM-2。油脂中对GO的抑制作用优于MGO，当添加浓度达到1.0 mmol/L时，MM-1、DM-2、槲皮素对MGO的抑制率分别为27.5%、21.2%、39.3%，对GO的抑制率为40.5%、28.8%、56.0%。

2.4 槲皮素加合产物对高温条件下卵白蛋白-葡萄糖体系中MGO、GO和AGEs形成的影响

模拟食品加工条件，构建卵白蛋白-葡萄糖反应体系。选择反应温度110 ℃[24]（烘焙蛋糕中心温度），新鲜鸡蛋的pH 8.0（新鲜鸡蛋）。如图5所示，反应时间为30 min时，MGO、GO和AGEs均达到峰值而后维持稳定。MGO（179.5 µg/g）含量的最大值是GO（51.4 µg/g）的3.5 倍，推测卵白蛋白在糖基化过程中形成的主要产物是MGO。鉴于30 min 3 个指标均达到最大值，后续选择30 min作为反应时间。

图6 MM-1、DM-2和槲皮素在卵白蛋白-葡萄糖体系（110 ℃、pH 8.0、浓度比1:1 250、30 min）中对MGO（A）、GO（B）和AGEs（C）抑制率的影响Fig. 6 Inhibition of Mono-MGO (MM-1) and di-MGO (DM-2)quercetin adducts and quercetin on the formation of MGO (A) , GO (B)and AGEs (C) in a dose-dependent manner in OVA-glucose system

由图6可知，MM-1、DM-2、槲皮素在110 ℃高温条件下，对MGO、GO和AGEs均有一定的抑制效果，抑制率随着抑制剂浓度（0.05～1 mmol/L）的增加而增大，呈现很好的量效关系，且同种抑制剂不同浓度间抑制率差异显著（P＜0.05）。

相同浓度时槲皮素及其加合产物对MGO、GO和AGEs的抑制率由高到低依次是槲皮素＞MM-1＞DM-2。当样品浓度达到1 mmol/L时，MM-1、DM-2、槲皮素对MGO的抑制率为28.8%、24.9%、36.0%，对GO的抑制率为48.8%、45.8%、51.8%，对AGEs的抑制率为78.4%、75.3%、83.0%。

槲皮素加合产物在卵白蛋白-葡萄糖体系中抑制MGO、GO和AGEs的变化趋势与文献[21]报道中赖氨酸-葡萄糖体系相一致，进一步验证了槲皮素捕获MGO后的产物在美拉德反应过程中依然具有活性，并参与抑制反应。槲皮素加合产物对AGEs和GO的抑制效果，卵白蛋白体系与氨基酸体系相似；但对MGO的抑制率低15%左右。其原因可能是卵白蛋白-葡萄糖体系中MGO生成量过高，该含量是GO的3.5 倍，而在赖氨酸-葡萄糖反应体系中的MGO和GO生成的量相近。

2.5 槲皮素加合产物对生理条件下牛血清白蛋白-葡萄糖体系中MGO、GO和AGEs形成的影响

牛血清白蛋白与人血清白蛋白有80%的同源性，且结构组成相似[25]，因此牛血清白蛋白可以替代人血清白蛋白应用于蛋白质的糖基化研究。如图7A所示，随着时间的延长（0～30 d），MGO和GO的含量不断增加；在0～3 d内MGO和GO的含量增加缓慢，这是因为在低温（37 ℃）条件下，美拉德反应进行得非常缓慢[26]，在3～6 d内，MGO和GO的含量均快速增加，且GO含量远高于MGO；6 d后MGO的含量高于GO的含量，在8 d时MGO和GO含量均达到最大值，分别为35.2 µg/g和32.1 µg/g，在8～30 d变化趋势不明显。据文献报道，体内细胞中MGO和GO的浓度为1～2 µmol/L，细胞半数致死浓度为0.3～1 mmol/L[27]，1,2-二羰基化合物浓度过高会引起机体蛋白质交联[28]、组织损伤[29]、破坏蛋白质结构与功能[30]等。因此，有效抑制体内MGO和GO的生成有重要的意义。

由图7B可知，从3 d开始随时间延长，形成的AGEs快速增多，在12 d达到最大值，产生荧光性AGEs的量是空白对照组的6.2 倍。AGEs的产生量变化趋势与MGO和GO的趋势基本一致。由此选择反应时间12 d，研究在牛血清白蛋白-葡萄糖体系中槲皮素加合产物的抑制效果。

图7 时间对牛血清白蛋白-葡萄糖体系（37 ℃、pH 7.4）中MGO、GO（A）和AGEs（B）产生量的影响Fig. 7 Effect of reaction time on the production of MGO/GO (A) and AGEs (B) in BSA-glucose system (37 ℃, pH 7.4)

如图8所示，MM-1、DM-2、槲皮素在生理条件下对MGO、GO和AGEs的抑制率与添加量呈现量效关系，同种抑制剂不同浓度间的抑制率差异性显著（P＜0.05）；浓度相同时，槲皮素及其加合产物对3 个指标的抑制率均为槲皮素＞MM-1＞DM-2，且差异性显著（P＜0.05），这与加工条件下的变化趋势相一致。

图8 MM-1、DM-2和槲皮素在牛血清白蛋白-葡萄糖体系（37 ℃、pH 7.4、12 d）中对MGO（A）、GO（B）和AGEs（C）抑制率的影响Fig. 8 Mono-MGO (MM-1) and di-MGO (DM-2) quercetin adducts and quercetin inhibited the formation of MGO (A), GO (B) and AGEs (C)in a dose-dependent manner in BSA-glucose system (37 ℃, pH 7.4, 12 d)

当样品的浓度为1.0 mmol/L时，MM-1、DM-2、槲皮素对MGO的抑制率分别为14.6%、11.6%、19.7%；对GO的抑制率分别为16.9%、12.6%、21.3%；对AGEs的抑制率为58.0%、46.7%、71.3%。以上实验结果与加工条件下的抑制效果相比偏低，推测主要是由于在生理条件下，蛋白糖基化反应缓慢，形成的MGO、GO和AGEs的量较低。该实验结果验证在体内环境中，槲皮素与MGO形成的加合产物依然可以起到抑制MGO、GO和AGEs生成的功效。

3 结 论

槲皮素与MGO形成的MM-1和DM-2均具有较好的还原性和油脂抗氧化活性。在高温油脂体系、卵白蛋白体系和生理条件实验中，MM-1和DM-2对MGO及GO的抑制率均随添加量的增大而提高，对GO的抑制效果优于MGO，活性依次为DM-2＜MM-1＜槲皮素。由此可知，槲皮素的A环在捕获MGO形成加合产物后，依然具有一定的抗氧化及抗蛋白糖基化的后续活性。