PRMT7与HSPA5相互作用促进肺癌转移的研究

程德志，徐朝娜，张 翔，郑亮承，张信波，谢德耀

0 引言

蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMTs)将供体S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到精氨酸残基胍侧链的末端氮原子上，即完成精氨酸的甲基化修饰[1]。目前已经鉴定出11种PRMTs家族成员，其中PRMT7涉及到很多细胞生理过程，如DNA转录、RNA拼接、DNA损伤修复和转移。PRMT7可以通过甲基化组蛋白H2AR3和H4R3来调节细胞对DNA损伤的反应[2]。已有证据证明，PRMT7与乳腺癌有关。然而，关于PRMT7与肺癌之间的确切关系的信息少之又少。鉴于PRMT7涉及多种生理过程，我们必须清楚地了解其细胞基质及其在肺癌中的作用。为了研究PRMT7在肺癌中的潜在作用，本研究进行了基于免疫共沉淀和质谱分析的蛋白质筛选。经过一系列综合分析，得到5个候选基因，其表达与所有其他基因不同，可能是肺癌的潜在转移介导基因。通过进一步分析，证明PRMT7在肺癌转移中起着关键作用，而HSPA5是其中的重要底物。

1 材料与方法

1.1 PRMT7过表达对肿瘤细胞侵袭和生长的影响

1.1.1 细胞活性检测(CCK8法) 取对数生长期的细胞，消化收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用新鲜的完全培养基重悬各组细胞；分别对细胞进行计数后，调整细胞密度为5×104cells/ml。100 μl/孔，铺96孔板；每组细胞铺板4*6孔；铺板0、24、48、72 h。CCK8检测：每个时间点，每组细胞各取6孔，加入10 μl CCK8反应液，3 h后酶标仪检测450 nm和620 nm吸光度。

1.1.2 细胞侵袭实验 Matrigel铺胶；将配置好的胶液，取30 μl加入小室内，均匀平铺，进行膜包被，先在4 ℃冰箱平衡1 h左右，37 ℃培养箱中放置30 min以上，使胶凝固备用；收集细胞，调整细胞数开始试验，经膜润湿、小室细胞培养染色、固定、染色、水洗等过程后，显微镜拍照。

1.2 PRMT7过表达细胞免疫共沉淀实验及质谱分析 在A549、SPC-A1和MDA-MB-231细胞系中用PRMT7抗体质谱分析IP样品[3]，并进行免疫共沉淀实验(Co-IP)[4]。经SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色，对不同的质谱带进行染色，从而得到结果。从质谱分析的结果中，选择几种与PRMT7高度相关的蛋白质进行进一步的免疫共沉淀验证。

1.3 微阵列数据分析与网络交互研究 Gene Expression Omnibus的基因表达数据库(序号GSE43580)用于lncRNA分析[3]。筛选与肺癌有关的数据并对其进行处理。在该过程中，混合信号被转换成表达式信号。对150个样品使用Affymetrix human U133 plus.2.0芯片。通过微阵列数据分析，确定了肺癌中PRMT7以及相关的lncRNA的表达。然后进行质谱数据分析，确定PRMT7相关的蛋白质。

2 结果

2.1 PRMT7在肺癌细胞中上调 为了探究PRMT7的基本表达水平，我们以人类蛋白质ATLAS公共资源为根据，分析了位于人体各类癌细胞系和正常组织的PRMT7的RNA-Seq数据库。数据记录的是每百万转录本的平均值(TPM)，并按组织类型归类。结果表明，PRMT7可以在正常组织中表达，如输卵管、肺、乳房、结肠和直肠。采用GENT数据库中的数据制成图1A、图1B。PRMT7在所有癌症组织和健康组织中的表达水平如图1A所示。PRMT7在肺癌中的表达低于正常肺组织，差异有统计学意义(图1B)。图1C显示了不同分子量小干扰RNA在细胞系中的作用，确定了蛋白水平和RNA水平降低了80%。肺癌细胞A549和SCLC-21H将PRMT7的TPM提高到30以上。PRMT7水平升高表明PRMT7可能会在肺癌中发挥作用。

2.2 PRMT7过表达对肿瘤细胞侵袭和生长的影响 为进一步研究PRMT7在肺癌中的作用，我们进行了一系列功能测定。以A549和SPC-A-1肺癌细胞为模型。细胞侵袭24 h后，实验中各组基质胶上细胞密度如图2A所示。结果显示，与对照组相比，肺癌细胞A549和SPC-A-1经过PRMT7过表达后，其侵袭能力增强(侵袭细胞数显著增加)。

因此，PRMT7的过表达影响了肺癌细胞A549和SPC-A-1的侵袭，PRMT7可能参与了肺癌的转移(Blank：转染的肿瘤细胞；shControl：PRMT7-siRNA 质粒和PRMT7过表达质粒共转染的肿瘤细胞；PRMT7：PRMT7过表达质粒转染的肿瘤细胞)。

对上述细胞(A549,SPC-A-1)进行细胞克隆形成研究结果显示，PRMT7的过表达对肿瘤细胞的克隆形成没有显著影响(Blank：转染载体质粒的空白对照组；shControl：PRMT7过表达质粒和PRMT7-siRNA干扰质粒共转染的阴性对照组；PRMT7：转染PRMT7过表达质粒的实验组，如图2B、2C所示)。PRMT7的过表达不能在很大程度上影响细胞增殖。这2种细胞系的集落形成能力也没有显著的变化。此外，在PRMT7过表达的影响下，在A549细胞中，细胞集落形成能力得到轻微增强，但无明显差异，表明PRMT7主要影响肺癌的转移。

图1 PRMT7提高肺癌细胞侵袭的能力

2.3 与PRMT7相互作用的新型蛋白质的鉴定 在A549和SPC-A-1细胞上进行PRMT7免疫共沉淀检测，银染色结果如图3A所示。A549细胞的分析显示，有4个不同的条带，分别位于250、120、90、80 kD附近。此外，SPC-A-1细胞有5个不同的条带，分别位于200、120、110、90、65 kD附近。为进一步证明结果，应用质谱分析法确定条带中的物质。根据质量和分数，获得了初始的79个候选蛋白质。采用KEGG通路分析、基因本体分析(GO)、蛋白质结合和转录因子分析对79个候选蛋白进行系统分析之后，我们得到了由A549和SPC-A-1共享的19个基因。最终选取5个基因，包括HSPA5、EEF2、PKM2、DLAT和XRCC6。功能分析中选择HSPA5基因，结果表明，不仅PRMT7的表达水平受到HSPA5的影响，PRMT7增强细胞入侵的能力也受到该基因的影响(图3C)。

2.4 HSPA5参与PRMT7诱导的肺癌转移 在进行Affymetrix人类阵列后，mRNA和lncRNA得到重新注释。被注释的mRNA中，150个样品中每一个都获得平均信号值。信号值小于标准阈值7的样本被滤除。共选择101个mRNA，其信号值大多接近PRMT7平均信号值。对所选的101个mRNA进行了通路分析和GO分析。选定的mRNA和lncRNA的共表达网络也得以形成(图4A)，选择其中与PRMT7高度相关的lncRNA进行进一步分析。在图4B中，给出了7种与PRMT7共表达的lncRNA，其相关性最高。通过基于U133 Plus2基因注释的RMA归化，获得150个样本的矩阵数据。RMA归化的信号值是重新调整的log2。基因注释包含基因描述，比如基因名称、染色体、基因开始和结束位置等。GSE43580数据集中，一共有6 278个lncRNA，39 574个封闭的mRNA，其中796个lncRNA具有非蛋白编码RNA。DAVID软件包用于在选定的101个mRNA上做GSEA[5]。Fisher精确检验用于揭示重要意义的分析中。

图2 PRMT7过表达对肺癌细胞侵袭和生长的影响

图3 HSPA5与PRMT7诱导的肺癌转移和侵袭有关

3 讨论

精氨酸的单甲基化修饰和二甲基化修饰反应是在哺乳动物中发现的，分别为：ω-ng-单甲基精氨酸(MMA)、ω-ng-ng-非对称型二甲基精氨酸(ADMA)、ω-ng-ng′-对称型二甲基精氨酸(SDMA)。PRMTs所产生的甲基精氨酸可分为3类：Ⅰ类，PRMT催化非对称型二甲基化；Ⅱ类，PRMT催化对称型的二甲基化；Ⅲ类，PRMT催化单甲基化。PRMT7是唯一同时具有Ⅱ类型和Ⅲ类型活动的基因[1]。

在不同的基质中甲基化精氨酸残基时，PRMT7涉及很多细胞生理过程，如DNA转录、RNA拼接、DNA损伤修复和转移。PRMT7可以通过甲基化组蛋白H2AR3和H4R3来调节细胞对DNA损伤的反应[2]。此外，还发现H3R2的PRMT7甲基化与转录有关[6]。通过分析胚胎干细胞和生殖细胞的核蛋白证实了PRMT7可以影响多能性。通过上调H4R3甲基化水平，使PRMT7压制miR-24-3p的转录，靶向主要多能因素的3′utr[7-8]。除了与组蛋白接触，PRMT7是snRNP组合所必需的，而这是剪接体的主要组成部分[9]。已有研究表明，PRMT7与癌基因CTCFL相互作用[9]。最近研究表明，PRMT7可以通过调节DNMT3b/p21轴来保持肌肉干细胞的再生能力[10]。此外，PRMT7可能与治疗学相关。南怀仁等[11]观察到下调PRMT7能够使HeLa细胞对TOP1抑制剂喜树碱更加敏感。在乳腺癌的基因集富集分析(GSEA)中发现PRMT7是潜在的转移基因之一。由于上皮细胞向间质细胞转化，PRMT7促进乳腺癌转移[12-13]。

PRMT7是促进乳腺癌转移的基因之一。本研究中发现，PRMT7的表达在肺癌中增加了3倍。PRMT7对肺癌细胞的侵袭能力明显较其他细胞增强。然而，肺癌中PRMT7的超表达并没有明显影响增殖和结肠的形成能力。进一步证实了PRMT7与肺癌之间的关系，并证实PRMT7是一种与肺癌相关的侵袭基因。

为探索PRMT7在肺癌细胞中侵袭作用的机制，本研究进行了质谱分析和免疫共沉淀实验，并通过对KEGG通路、GO、蛋白结合和转录因子等分析对其筛选。之后，选择了PKM2、HSPA5、EEF2、DLAT和XRCC6。如已有文献所记录，PKM2和HSPA5都与癌症侵袭有关。作为癌症糖酵解的关键酶，PKM与许多癌症有关。有报道，PKM2通过调节STAT3信号通路并影响肝门胆管癌的神经侵袭来促进结肠癌细胞迁移[14]。此外，降低PKM2可抑制肺腺癌的生长和侵袭[5]。因此，PRMT7伴侣蛋白是调节PRMT7诱导侵袭的一个关键因素。

图4 mRNA-lncRNAs共表达网络和lncRNA与PRMT7共表达

本研究应用蛋白质印迹分析检测共沉淀产物，以明确与5种候选基因中的PRMT7存在相互作用的蛋白质。通过使用siRNA影响HSPA的表达后，发现PRMT7的表达和诱导细胞侵袭功能被明显抑制。此外，由于缺乏临床转移样本，本研究通过TCGA在线数据库的150项肿瘤研究分析了HSPA的mRNA表达。分析表明，许多癌症可以表达HSPA5，肺癌中HSPA5的RNA表达高于大多数其他癌症。结果表明，HSPA5可能会增强PRMT7在肺癌细胞转移中的活性。

本研究证实，HSPA5是一种与PRMT7相互作用的新型蛋白，并参与PRMT7诱导的侵袭。其可能通过与PRMT7结合而成为独特的上游分子或其他信号通路的竞争者。HSPA5可以结合免疫球蛋白或78 kDa葡萄糖调节蛋白，是位于内质网中的HSP70分子伴侣，保持蛋白质处于适合随后折叠和低聚的状态。HSPA5含有2个功能域：结合并水解ATP的核苷酸结合结构域和结合多肽的底物结合结构域[15]。脱乙酰化的或抑制的HSPA5可以抑制乳腺癌的迁移和侵袭[16-17]。HSPA5中的FOXM1对结肠直肠癌细胞的侵袭和迁移有部分促进作用[18]。受HSPA5约束的PRMT7与肺癌的侵袭相关，证明了PRMT7的独特作用，可以部分解释肺癌转移。PRMT7与HSPA5蛋白质相互作用的深入研究将为阐明PRMT7在肺癌细胞转移中的作用机制奠定基础。