高效液相色谱法测定大鼠血浆中木樨草素和牡荆素的含量

才志阳，赵楠，郭伟英

(1.锦州医科大学附属第一医院药品管理科；2.锦州医科大学附属第一医院转化医学研究院；3.锦州医科大学药学院药物分析教研室，辽宁 锦州 121000)

葎草(humulus scandens)为桑科植物葎草的全草，又名勒草、老虎藤。最早见于《唐本草》。植株分布于除新疆、青海以外的大部分地区。传统医学认为其具有清热解毒，退热除蒸，利尿通淋等方面的功效[1-2]。药用成分主要是葎草总黄酮，包含木樨草素、牡荆素等成分。经过药理学研究[3-5]，发现葎草总黄酮对于溃疡性结肠炎具有明显的抑制作用。

本实验以前期药理学实验[6]为基础，进一步探讨葎草总黄酮在体内的代谢情况，建立葎草总黄酮体内检测的高效液相色谱方法，为下一步研究其分子生物学相关机制提供可靠的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

赛里多斯pH仪(北京赛利多斯)；Agilent1100(G1314A)高效液相色谱系统(美国Agilent公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣)；Milli-Q Synthesis制水系统(美国Millipore公司)；AL204电子天平(上海梅特勒-托利多仪器)；TGL-16台式高速离心机(江苏金坛市医疗仪器厂)。

1.2 试药

葎草总黄酮结肠定位胶囊(锦州医科大学药物分析教研室制备，经HPLC法测定含有木樨草素1.52 mg/g，牡荆素0.32 mg/g)，木樨草素(sigma，批号62696)牡荆素(111K1520)，甲醇(天津富宇化工)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 实验动物

锦州医科大学SD大鼠(动物生产合格证号：SCXK(辽)-2003007)，体重(245±15)g，雌雄各半。试验前禁食12 h自由饮水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)进行分析。VWD型检测器，流动相：甲醇-20 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(58∶42，pH=4.0)，流速为1.0 mL/min。进样量：20 μL，检测波长在350 nm，柱温30 ℃。水为超纯水。

2.2 标准溶液的配置

2.2.1 标准储备液的制备 分别精密称取60 ℃减压干燥8 h的木樨草素与牡荆素对照品适量，置于同一25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释制成浓度为232.0、99.2 μg/mL的标准储备液。分别取标准储备液(见表1)适量并加入流动相，将标准储备液稀释2、3、5、10、50、150倍，用于线性范围、回收率、准确度、精密度和稳定性的考察。

表1 标准储备液浓度(μg/mL)

2.2.2 含药血浆样品的配制 取标准储备液分别加入流动相适量，将标准储备液稀释6 000、2 000、400、200、120、80、53倍，各取5 μL分别溶于用0.2 mL空白血浆中。用于校准曲线的建立。血浆标准工作溶液(见表2)每天临用前现配制。

表2 血浆标准工作溶液浓度

2.2.3 血浆样品的处理[7]将0.2 mL 6.0%的高氯酸缓慢加入到0.2 mL空白血浆中，将样品中的血浆蛋白充分沉淀。用3.0 mL乙酸乙酯涡旋提取木樨草素和牡荆素5 min。3 500 r/min 离心10 min，转移上清液2.0 mL小心转移至干净的尖底离心管中，室温下在真空干燥器中挥干乙酸乙酯。向残留物中加入250 μL流动相，12 000 r/min离心10 min，取上清液进样。

2.2.4 血浆样品的采集 大鼠禁食12 h后给予自制结肠定位胶囊，分别在0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 h后采集血液样本1.0 mL，分别放于含有肝素的5 mL管中，于3 000 r/min分离血浆。以0 h的取样作为空白血浆，所有血浆样品的处理方法同2.2.3。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 实验色谱条件下，木樨草素和牡荆素分离度良好，理论塔板数按木樨草素计算不低于4 000，血浆内源性杂质对于分离木樨草素和牡荆素没有干扰。木樨草素和牡荆素的保留时间约为11.0 min和17.0 min，见图1。

2.3.2 线性关系 以木樨草素、牡荆素的峰面积作为纵坐标，以木樨草素、牡荆素的浓度为横坐标，进行线性回归分析(见表3和4)。结果表明，鼠血浆中木樨草素和牡荆素校准曲线在38.50～4 350 ng/mL和16.50～1 860 ng/mL范围内呈线性关系，相应的木樨草素和牡荆素回归方程分别为y1=0.133 7x+0.541 9(r=0.999 6，n=7)，y2=0.110 3x+0.512 5(r=0.999 4，n=7)。

A：空白血浆色谱图；B空白血浆中加入1 158 ng/mL木樨草素和495 ng/mL牡荆素的色谱图；C：给予结肠定位胶囊4 h后的血浆色谱图(1为木樨草素，2为牡荆素)

图1 不同条件下的色谱图

表3 木樨草素标准曲线相关数据

表4 牡荆素标准曲线相关数据

2.3.3 方法与绝对回收率考察 取大鼠空白血浆，分别加入木樨草素和牡荆素标准溶液，配制成低，中，高3种浓度(表5)的标准血浆各5批(n=5)，按2.2.3的方法进行处理，进行回收率考察。

2.3.4 重复性与精密度 精确配制高、中、低3个浓度(见表6)的血样，同日内测定5批，计算日内相对标准差；隔天测定1批，连续测定5批，计算日间相对标准差。从结果可知日内精密度<7.9%，日间精密度(RSD)<5.4%，见表6。

表5 回收率考察(n=5)

表6 木樨草素和牡荆素精密度考察(n=5)

2.3.5 稳定性 精确配制低、高两种浓度(38.5/16.5ng/mL，4 350/1 860 ng/mL)的血浆样品，一式3份，放置于3种不同环境下进行稳定性试验。在短期稳定性试验中，血浆样品放置于冰箱中(4 ℃)，分别于0、2、4、8、12、24 h测定；在长期稳定性实验中，血浆样品放置于冰柜中(-20 ℃)，分别于1、3、7、15、30 d进行测定。结果表明，短期试验中回收率变化为94%～105.1%(低浓度)，95.2%～103.2%(高浓度)；长期实验中回收率变化为97.6%～107.5%(低)，95.2%～103.2%(高)。稳定性实验表明：木樨草素和牡荆素血浆样本在上述情况下稳定性良好。

2.3.6 检测限及定量限 方法的最低检测浓度，当信噪比S/N=3时，木樨草素和牡荆素的最低检测限为1.82和1.94 ng/mL。

定量限，样品中被测物能被定量测定的最低量。大鼠血浆中木犀草素和牡荆素的定量限分别为7.84 ng/mL和6.29 ng/mL，RSD分别为6.2%和5.9%。

3 样品测定

给予大鼠口服结肠定位胶囊，按照2.2.4进行血样采集，测定血浆中木樨草素和牡荆素的浓度(见图2)。但由于血浆中牡荆素的浓度低于检测限，只检测出木樨草素。

图2 不同时间点血浆中木樨草素浓度

4 讨 论

去除血浆样品中的蛋白质是保证药物释出与样品干净的重要前提。血浆中的蛋白质沉淀一般采用沉淀剂或利用酶消化法实现。而蛋白质的沉淀效率与介质的pH值和沉淀剂体积有关。在实验中，分别对乙腈和甲醇的除蛋白效果进行了考察。结果显示，两者蛋白沉淀效果不佳，内源性物质对物质的分离干扰较为严重。最后采用6%的高氯酸，沉淀效果显著，干扰分离的内源性物质较少。

从血浆中萃取分离物质，多采用不同比例的丙酮与醚类，提取的回收率一般在55%、40%[8]。我们通过对木樨草素和牡荆素两种物质的结构进行分析并结合相似相溶的原理，采用乙酸乙酯进行萃取。回收率有了明显的提升，分别达到了88%和90%。

流动相的pH对物质的出峰时间和峰形有着巨大影响。当pH>6.0时，出峰时间在17 min以后，峰宽变宽，出现拖尾现象。pH过低，药物出峰时间前移，但峰形出现分裂，分析认为是药物形态影响了峰形。即在一定pH条件下，药物以分子和盐的形式存在于流动相中。经过摸索，最终选择了甲醇20 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(58∶42，pH=4.0)作为流动相，谱图显示峰形良好。

实验过程中发现，木樨草素和牡荆素的代谢情况表现出了极大的差异性。经查阅有关文献[9]得知，牡荆素的体内代谢过程中，体内酚的含量会发生变化，可能是体内某些酚类成份参与了牡荆素的代谢过程。考虑到血浆中木樨草素和牡荆素浓度的差异，推断两者具有不同的代谢途径，参与代谢酶系的活性也有较大的差距。