小柴胡汤联合紫杉醇对人口腔鳞癌细胞凋亡机制的影响

潘清华 刑永新

(兴安职业技术学院五官科，内蒙古 乌兰浩特 137400)

口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，其中口腔鳞癌占90%以上，因其生长快、浸润性强、转移率高，是患者死亡的主要原因〔1，2〕。小柴胡汤能提高机体免疫力及有明显的抑瘤作用，其抗肿瘤作用在S180、Lewis、C6等荷瘤鼠中已有广泛研究〔3～5〕。紫杉醇是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的抗癌症临床药物，通过促进微管聚合抑制微管解聚形成稳定的微管聚合物，进而抑制增殖细胞的有丝分裂、诱导细胞凋亡，最终导致肿瘤细胞死亡〔1，6～9〕。本实验通过建立人口腔鳞癌细胞CAL27荷瘤小鼠模型，检测血清及肿瘤组织中B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白含量及蛋白阳性表达强度，进一步探讨小柴胡汤的抑瘤机制和联合用药的增强剂作用。

1 材料与方法

1.1材料 小柴胡汤组成〔3〕：柴胡(78.125 g)；黄芩(46.875 g)；人参(46.875 g)；清半夏(42.000 g)；炙甘草(46.875 g)；生姜(46.875 g)；大枣(30.000 g)。紫杉醇由Sigma公司提供；人口腔鳞癌细胞CAL27购于长春鼎国生物有限公司；Bcl-2、 Bax酶联免疫吸附试剂盒均由南京建成生物有限公司提供；兔抗Bcl-2、 Bax购于北京博奥森生物有限公司；SP9710试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于福州迈新生物有限公司。

1.2模型制备与实验分组 取培养的人口腔鳞癌CAL27细胞，制成2×106/20 μl的CAL27细胞悬液，接种于雄性9周龄BALB/c裸鼠、右前肢腋窝皮下，体重(26.8±1.2)g，待肿瘤长至0.5 cm×0.5 cm时，随机分为肿瘤对照组(灌胃给予生理盐水+腹腔注射生理盐水)、小柴胡汤组(灌胃给予小柴胡汤+腹腔注射生理盐水)、紫杉醇组(灌胃给予生理盐水+腹腔注射紫杉醇)、联合用药组(灌胃给予小柴胡汤+腹腔注射紫杉醇)各12只。

1.3中药制备〔3〕小柴胡汤中7味中药以8倍量蒸馏水浸泡30 min，加热保持微沸30 min，过滤；残渣加6倍量蒸馏水，微沸30 min，过滤；合并2次滤液，混合后滤液干燥浓缩至100 ml，即小柴胡汤E(10 g/ml)；以类似方法浓缩熬制小柴胡汤D(20 g/ml)；小柴胡汤C(50 g/ml)；4℃冰箱保存备用。

1.4给药方法及取材 每组灌胃及腹腔注射量均为0.1 ml，小柴胡汤组50 g/kg、紫杉醇30 mg/kg连续隔天给药7次，于最后一次给药后第2天处死小鼠，眼球取血(3 000 r/min离心10 min)及肿瘤组织(部分-20℃冻存待测，部分固定于4%多聚甲醛液中)。

1.5荷瘤小鼠血清及肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白含量检测 使用仪器Epoch酶标仪(美国)，采用酶联免疫吸附试验检测荷瘤小鼠血清及肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白含量，严格按照试剂盒方法操作。

1.6荷瘤小鼠肿瘤组织中Bcl-2、 Bax蛋白阳性表达强度检测 肿瘤组织4%多聚甲醛固定，常规脱水、包埋、切片两张，厚度3 μm，80℃烤箱烘烤6 h采用免疫组织化学方法检测。采用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统检测光密度(OD)值，OD值越大阳性表达越高。

1.7统计学方法 采用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

与肿瘤对照组比较，小柴胡汤、紫杉醇、联合用药组血清及肿瘤组织Bcl-2蛋白含量及蛋白阳性表达强度明显降低，且依次降低趋势明显，组间差异有统计学意义(P<0.05)，Bax蛋白含量及蛋白阳性表达强度明显升高，且依次升高趋势明显，组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表1，图1。

表1 各组血清、肿瘤组织中Bcl-2、 Bax蛋白含量及蛋白阳性表达强度比较

与肿瘤对照组比较：1)P<0.05；与小柴胡汤组比较：2)P<0.05；与紫杉醇组比较：3)P<0.05

图1 各组Bcl-2、Bax表达(×200，免疫组化SP染色)

3 讨 论

口腔鳞状细胞癌是额面部最常见的恶性肿瘤，其发病率及发病年轻化趋势日益升高〔1，2〕。研究发现细胞凋亡、细胞周期调控及凋亡调控相关基因与肿瘤的侵袭、转移、预后密切相关〔2〕。

Bcl基因是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族，Bcl-2、Bax是其中两个重要成员，二者具有同源性，但生物学作用相互拮抗〔10～12〕。Bcl-2是一种抑制凋亡基因也是存活基因，能通过抑制细胞凋亡而延长细胞寿命〔13，14〕。Bax是一种促凋亡基因，可对抗Bcl-2活性，能通过促进细胞凋亡而减少细胞寿命〔12，15〕。Bcl-2在肿瘤组织中的高表达和Bax在肿瘤组织中的低表达，均可促进肿瘤生长，二者与肿瘤的发生发展密切相关。

本研究结果说明小柴胡汤、紫杉醇均能够通过下调Bcl-2、上调Bax表达水平，从而抑制肿瘤的生长，二者联合用药作用更为显著，因此小柴胡汤除自身的抗肿瘤作用得到验证，联合紫杉醇用药还能起到增强剂的作用，更好地诱导细胞凋亡通路，从而发挥其肿瘤治疗增强剂的作用，为小柴胡汤联合用药的推广应用提供科学依据。