脂联素对老龄小鼠心肌炎症因子TNF-α、IL-6表达及左心室舒张功能的影响

李 洁 安 丽 任利群

(东南大学附属中大医院老年科，江苏 南京 210009)

随着人口老龄化的发展，左心室射血分数正常心衰(HFpEF)的发病率显著上升，60岁以上老年人的平均发病率为36.0%〔1〕。血浆脂联素(APN)是脂肪细胞分泌的一种细胞因子，具有改善胰岛素敏感性、保护血管内皮、抗动脉粥样硬化和抗炎特性〔2〕。研究表明，高血压患者血浆APN水平与左心室肥厚程度呈负相关〔3〕。来自美国〔4〕、日本〔5〕的一系列研究结果均显示健康百岁或更年老的老年人APN水平较95岁以下或70岁以下者明显增加，推测APN可能与衰老相关的心脏功能密切相关。本研究拟应用APN基因敲除老龄小鼠动物模型，探讨APN对于老龄小鼠心肌炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6表达及左心室功能的影响。

1 材料和方法

1.1动物及分组 APN基因敲除小鼠及野生小鼠由Jackson Laboratory公司提供，均为 C57BL/6J 种系，雄性，每组10只，青年组2月龄，老龄组18月龄。

1.2主要试剂 APN酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自美国Biovision公司，Prime Script TM RT regent Kit购自美国Qiagen公司，Trizol、PCR引物购自美国Invitrogen公司。

1.3超声心动图检查 各组小鼠称重后用10%(3 ml/kg)水合氯醛进行腹腔麻醉，心前区备皮，采用30 MHz探头的Vevo770高分辨超声影像系统，选取左心室长轴切面、左心室乳头肌水平短轴切面及心尖四腔切面，在二维、M型、二尖瓣血流频谱多普勒、组织多普勒(TDI)下测定以下参数：左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室射血分数(LVEF)、短轴缩短分数(FS)、二尖瓣舒张早期血流速度(E)、二尖瓣舒张晚期血流速度(A)、二尖瓣环舒张早期运动速度(E′)、二尖瓣环舒张晚期运动速度(A′)。每个值取3个连续心动周期测量的均值。

1.4血流动力学指标检测 各组用10%(3 ml/kg)水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，经右颈动脉插管至左心，用BL-410多功能监护仪监测血流动力学变化，即左心室收缩末压(LVESP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、收缩末期压力-容积关系(ESPVR)、舒张末期压力-容积关系(EDPVR)及Tau指数。测量后开胸，取血，生化自动分析仪测定各组血糖、血脂水平，留取心室组织液氮中保存备用。

1.5ELISA检测 用ELISA测定血清中APN的含量，操作按试剂盒说明书要求进行。

1.6实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织中TNF-α、IL-6 表达 Trizol法提取总RNA，并将RNA反转录为cDNA。小鼠TNF-α引物：5′-CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG-3′，5′-CAC CAG CTG GTT ATC TCT CAG CTC-3′；小鼠IL-6引物：5′-TTC CAA TGC TCT CCT AAC AG-3′，5′-CTAGGTTTGCCGAGTAGATC-3′；GAPDH引物：5′-AAA GGG CAT CCT GGG CTA CA-3′，5′-CAG TGT TGG GGG CTG AGT TG-3′。PCR反应体积5 μl，其中包括Power SYBR Green PCR Master Mix(2×)2.5 μl，超纯水1.25 μl，上下游引物各0.125 μl及稀释的cDNA 1 μl。每组设3个复孔，以GAPDH作为内参照，PCR反应条件为：预变性95℃3 min，94℃45 s，62℃30 s，72℃60 s，目的基因循环32次，内参照循环27次，结束循环后再延伸72℃10 min，以目的基因与GAPDH比值进行定量分析。

1.7统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组生化指标及血清APN水平 青年APN基因敲除鼠组(QAPNKO组)血清APN水平<0.05 μg/ml，其血糖、TC、TG水平与青年野生小鼠组(QWT组)相比差异无统计学意义；老龄野生小鼠组(LWT组)与青年野生小鼠组(QWT组)相比，血清APN水平明显增高(F=7.33，P<0.05)，血糖、TC、TG水平增加，但差异无统计学意义；老龄APN基因敲除鼠组(LAPNKO组)血清APN水平<0.05 μg/ml，与老龄野生小鼠组(LWT组)相比，其血糖、TC、TG、低密度脂蛋白(LDL)水平明显增高(F值分别为264.27，254.42，22.88，70.84，均P<0.05)，见表1。

表1 各组体重、血糖、血脂及血清APN水平

与QWT组相比:1)P<0.05；与QAPNKO组相比:2)P<0.05；与 LWT组相比:3)P<0.05；下表同

2.2各组心肌TNF-α，IL-6基因表达 LAPNKO组与LWT组相比，心肌炎症指标TNF-α，IL-6 基因表达明显增高(F值分别为4 502.20，6 252.79，均P<0.05)，见表2。

2.3各组心脏超声心动图参数 与LWT组相比，LAPNKO组LVEF及左室FS差异无统计学意义(F值分别为3.05，3.95，均P>0.05)，但LAPNKO组E′/A′较LWT组明显减低(F=14.7，P<0.05)；E/E′明显增加(F=24.0，P<0.05)，见表3。

2.4各组血流动力学参数 LAPNKO组与LWT组比较EDPVR及Tau指数均显著增高(F值分别为56.83，271.06，均P<0.05)，见表4。

表2 各组心肌炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA表达水平

表3 各组心脏结构与功能指标

表4 各组血流动力学参数

3 讨 论

随着增龄而出现机体器官老化，心肌衰老以心脏结构和功能的变化为主要特征。研究表明，脂肪细胞功能与增龄相关的心血管和代谢性疾病密切相关，提示脂肪细胞因子可能影响机体的衰老过程〔6〕。APN是脂肪细胞分泌的一种有益的细胞因子，参与调节机体能量代谢，研究表明，APN可通过腺苷酸活化蛋白酶(AMPK)及环氧化酶(COX)-2抗炎途径抑制心肌细胞和成纤维细胞的凋亡及炎症反应〔7〕。本研究结果提示老龄野生小鼠左心室舒张功能减低。APN缺乏可诱发衰老过程的血糖血脂代谢紊乱，加速心肌衰老过程的炎症反应，对于老龄左室舒张功能不全的发病具有重要意义。研究发现，老年慢性心力衰竭患者血清APN水平越高，LVEF越低，心衰患者预后越差〔8〕，与本研究结果不一致，可能与其入选的研究对象为左心室射血分数下降心衰(HFrEF)患者有关，另外，病理条件下机体可能存在某种反馈机制影响血清APN水平。APN调控衰老相关的HFpEF分子机制有待进一步研究。