柚皮素改善糖尿病肾病模型小鼠病情及机制研究*

屈春梅，李红梅

(重庆市红十字会医院/江北区人民医院：1.内分泌科；2.儿科 400020)

糖尿病肾病 (diabetic nephropathy，DN)是糖尿病慢性并发症之一，约1/3的终末期肾病是由DN引起，威胁着人类的健康。但由于多种复杂致病因素参与DN的病理生理过程，其发病的确切分子机制目前仍不清楚。由于DN患者常交织着高糖、脂代谢异常、血流动力学紊乱、异常氧化应激状态及炎症状态等复杂情况，随着病程的进展，治疗较其他肾病困难，严重影响了糖尿病患者的预后和生存。而目前没有能有效治愈DN的方法，因此DN的早期防治意义重大。柚皮素亦称为4,5,7-三羟基二氢黄酮，作为一种天然化合物广泛存在于自然界柑橘类水果、某些植物及中药药材中。目前已发现柚皮素在延缓肿瘤、拮抗病毒、调节糖脂代谢紊乱等多方面均等具有广泛作用[1]。同时，它在改善氧化应激方面还具有消除氧化自由基的效能[2]，在肝脏疾病、肿瘤等多疾病中均发现它可通过抗氧化机制影响疾病的发生[3-4]。新近研究报道柚皮素可通过 Let-7a/TGFBR1信号途径影响糖尿病肾病大鼠肾脏损伤[5]，但是柚皮素对糖尿病肾病小鼠氧化应激的影响尚未见报道。因此本研究拟通过观察柚皮素对糖尿病肾病小鼠血糖、尿清蛋白及氧化应激因子一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)的影响，来探讨柚皮素对糖尿病肾病小鼠发病的影响及抗氧化机制。

1 材料与方法

1.1材料 柚皮素标准品购自上海生工，用DMSO溶解成400 mmol/L的储存液，置于-20 ℃保存。NO测定试剂盒、NOS测定试剂盒和尿清蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，置于4 ℃保存。血糖仪及血糖试纸购自德国拜耳公司，常规保存。

1.2方法

1.2.1实验动物分组及处理 雄性4周龄清洁级糖尿病肾病模型动物db/db小鼠10只和对照db/m小鼠5只购自中科院上海实验动物中心，恒温条件饲养，检测小鼠的体质量、尾静脉血糖和尿清蛋白等指标，确定DN小鼠呈现血糖增高但尿蛋白阴性后进入实验分组：进行柚皮素50 mg·kg-1·d-1混悬液灌胃的小鼠为柚皮素组(5只)，进行等体积生理盐水灌胃的小鼠为空白对照组(5只)，正常对照组(5只)处理同空白对照组，实验直到空白对照组小鼠的尿清蛋白显著高于正常对照组小鼠，终止实验，共6周。实验期间每周测1次体质量和血糖，每两周测1次尿清蛋白。实验遵循本院伦理委员会标准进行。

1.2.2体质量及血糖、尿清蛋白指标检测 每周清晨称量各组小鼠体质量，收集尾静脉血后立即用血糖仪测血糖(德国拜耳)。每2周收集小鼠尿液测尿清蛋白，按按说明书严格进行。

1.2.3NO和NOS检测 清晨取尾静脉血后分离血清，-20 ℃保存备用。采用硝酸还原酶法检测血清NO；采用分光光度法检测NOS水平，操作步骤均按说明书严格进行。

2 结 果

2.1小鼠一般情况 4周龄DN小鼠较正常对照组小鼠血糖显著增高，尿清蛋白无显著性变化。连续实验6周后，空白对照组血糖尿清蛋白较正常对照组小鼠小鼠呈现升高。在柚皮素组中，血糖较空白对照组下降 (P<0.05)，尿清蛋白亦较空白对照组降低(P<0.01)。但在柚皮素治疗后体质量变化差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 小鼠一般情况比较

a：P<0.05，与正常对照组比较；b：P<0.05，与柚皮素组比较

2.2柚皮素对小鼠氧化应激因子NO和NOS的影响 各组小鼠NO和NOS检测结果见表2。

表2 小鼠NO和NOS检测

a：P<0.05，与正常对照组比较;b：P<0.05 ，与柚皮素组比较

3 讨 论

随着现代科技快速发展，具有疗效天然化合物越来越受到关注，特别是标准化提取后治疗疾病成为研究的热点。在天然化合物对DN的治疗上学者们也有所发现，川芎嗪、雷公藤多甙、黄连素及鲁斯可皂苷元等植物有效成分被发现可调节DN的发生、发展[6-9]，然而至今仍无确切报道。近年来，柚皮素这种从柑橘类水果、茶籽、长白瑞香等自然界植物中提取的带苦味的天然化合物被发现可能对糖尿病及其并发症有作用[10]。同时，学者们发现给予柚皮素的糖尿病小鼠不仅可在肝、肾脏检测到柚皮素的增加，而且病情得到缓解[11]；给予柚皮素的糖尿病大鼠亦呈现相似结果，其机制可能是柚皮素具有胰岛素样作用，抑制小肠能量吸收，从而达到改善病情的效能[12]；在高脂饮食的低密度脂蛋白剔除模型小鼠给予柚皮素治疗后，小鼠没有出现对照的肥胖、血胆固醇增高、胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受等症状[13]。以上均提示，柚皮素在DN的治疗中可能具有重要作用。本研究结果显示，DN小鼠经柚皮素治疗后，柚皮素组血糖水平较空白对照组降低，提示柚皮素对血糖的抑制作用，与前述研究结果一致。同时，柚皮素组较空白对照组尿清蛋白明显抑制，表明柚皮素对DN肾脏的确具有保护作用，可延缓尿清蛋白的出现，也与国内外结果趋势一致。但体质量在柚皮素治疗后未发现明显差异，结合其他文献，发现柚皮素对小鼠体质量有控制作用的小鼠模型均不是db/db小鼠，提示可能由于种系差异、病程早晚等因素导致本结果与其他研究不一致，柚皮素可能对早期db/db DN小鼠中体质量的影响不大。

为探寻柚皮素对DN作用的机制，氧化应激引起作者的关注。多项体内外研究表明在DN发生、发展的重要机制中，氧化应激占有重要地位。高血糖可介导氧化应激导致组织损伤，肾脏内部结构纤维化异常，加速DN演进。虽然对于糖尿病患者而言，体内持续高葡萄糖水平是引起糖尿病病情加重，肾脏等脏器结构功能异常的基础[14]，但他们体内严重的氧化应激状态则在DN等微血管并发症的发生中起到重要的推进作用[15]。目前，NO和NOS在DN氧化应激起到重要作用[16]，同时其合成量及活性水平与肾脏肾小球高滤过和尿清蛋白发生呈正相关[17]。本研究发现，空白对照组的db/db小鼠NO和NOS较正常对照组db/m小鼠显著增高，提示氧化应激参与DN的发生。同时，柚皮素治疗后的db/db小鼠较空白对照组NO和NOS显著降低，提示柚皮素可抑制DN小鼠NO和NOS的产生。由此表明，柚皮素可能通过拮抗氧化应激效应对DN产生作用。L-精氨酸在NOS作用下生成NO，目前已发现的NOS有3种类型，包括神经元型、内皮细胞型和诱导型，而与柚皮素作用DN中相关的NO究竟是由哪种具体类型的NOS产生，还需要深入的研究。

综上所述，柚皮素可缓解抑制糖尿病肾病小鼠尿清蛋白，其机制可能通过抑制NO和NOS拮抗氧化应激，从而对糖尿病肾病治疗具有一定作用。但由于DN的发病机制十分复杂，柚皮素对DN抗氧化应激效应的具体涉及的分子机制还需要进一步的研究。