孕期双酚A暴露对子代雄性大鼠生殖发育的影响

张昭玉，马林，李昀谦，王晨，赵晓茹，罗家权，马明月*

（1.沈阳医学院公共卫生学院预防医学专业2015级，辽宁 沈阳 110034；2.卫生毒理学教研室）

双酚A（bisphenol A，BPA），溶于水，易溶于醇、醚等，广泛应用于染料、杀菌剂、医疗器械、餐具、罐头内包装、饮料容器与食品包装材料、婴儿奶瓶的生产等［1-2］，是目前应用较广泛的环境内分泌干扰物。BPA可通过干扰内分泌系统对机体健康产生各种危害，如对生殖系统、免疫系统、神经系统的损害，与2型糖尿病及肥胖等的发生相关。已有研究证实，BPA可通过产生自由基造成组织器官和细胞的氧化应激，具有较强的氧化损伤作用［3-5］。BPA主要通过消化道等途径进入人体，在发育过程中可通过阻滞生殖细胞的减数分裂诱导细胞凋亡，影响睾丸发育系统，导致生殖系统损伤［6］。BPA对女性生殖系统的影响研究较多，但对男性生殖系统的影响报道甚少。因此本研究通过大鼠孕期BPA暴露，研究BPA对子代雄性大鼠生殖系统及机体抗氧化系统的损伤，为评估BPA对人群的危害及探讨其损伤机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 15只SPF级健康雄性SD大鼠、30只健康雌性SD大鼠（10周龄）由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验动物许可证号SYXK（辽）2010-0002，体重200～240 g，按1∶2比例进行合笼，次日晨起行阴栓检查，发现阴栓为妊娠第0天（gestation day 0，GD0）。动物饲养在符合GB 14925—2010《实验动物环境及设施》有关要求的屏障环境中，12 h/12 h昼夜光照循环，动物室相对温度（25±2）℃，相对湿度（50±2）%，自由进食、饮水。

将受孕雌性大鼠随机分成3组，溶剂对照组、BPA低剂量组（33.3 mg/kg）、BPA高剂量组（100 mg/kg），每组10只，各组均以5 mg/kg的体积进行灌胃。染毒从GD5开始，持续到GD21。子代雄性大鼠正常喂养至第10周后乙醚麻醉，腹主动脉采血分离血清备用，分离脏器检测各指标。

1.2 主要仪器与试剂 酶标仪、低速台式大容量离心机（美国Thermo公司）；正置显微镜（日本Nikon公司）；BPA（纯度＞99%，东京化成工业株式会社）；玉米油（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；乙醚（分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成生物有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 体重的测量 测定子代雄性大鼠生后第4周至第10周的体重。

1.3.2 血清中酶活性的测定 将子代雄性大鼠腹主动脉血放置4 h，然后3 500～4 000 r/min离心15 min，取上清进行后续实验。使用MDA、SOD、CAT、H2O2试剂盒测定 MDA、SOD、CAT、H2O2，按照试剂盒说明书进行检测。

1.3.3 肛殖距及各脏器系数的测定 测量子代雄性大鼠的肛殖距。准确称量大鼠体重和各脏器重量，并进行计算。例如睾丸脏器系数=双侧睾丸湿重（g）/体重（100 g）。

1.3.4 精子数、精子活动百分数的测定 取子代雄性大鼠附睾，将其置于1 ml生理盐水中，用眼科剪剪碎，制成精子悬液滴加到精子计数板，光学显微镜下计算精子数和和精子活动百分数。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，符合正态分布数据的组间比较采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，方差齐时用LSD进行两两比较；若方差不齐，则采用Dunnett's T3检验；若不满足正态性时，则采用非参数检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 孕期BPA暴露对子代雄性大鼠体重的影响 各剂量BPA暴露组子代雄性大鼠体重与对照组比较，体重均有一定程度的降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 孕期BPA暴露对子代雄性大鼠体重的影响（x±s，g）

2.2 孕期BPA暴露对子代雄性大鼠脏器系数的影响 与对照组比较，各剂量BPA暴露组子代雄性大鼠的肝脏系数、肾脏系数及睾丸系数比较差异无统计学意义（P＞0.05）；附睾系数比较差异有统计学意义（P＜0.05）；低剂量BPA暴露组和高剂量BPA暴露组子代雄性大鼠附睾系数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 孕期BPA暴露对子代雄性大鼠脏器系数的影响（x±s，g/100 g）

2.3 孕期BPA暴露对子代雄性大鼠肛殖距、精子数等的影响 3组肛殖距比较差异无统计学意义（P＞0.05）；高剂量BPA暴露组子代雄性大鼠精子数均低于对照组和低剂量BPA暴露组（P＜0.01）；各剂量BPA暴露组子代雄性大鼠的精子活动百分数均低于对照组（P＜0.01）。见表3。

表3 孕期BPA暴露对子代大鼠的肛殖距、精子数、精子活动百分数的影响（x±s）

2.4 孕期BPA暴露对子代雄性大鼠血清脂质过氧化指标的影响 3组子代雄性大鼠血清CAT活性比较差异无统计学意义（P＞0.05）；高剂量BPA暴露组血清H2O2含量、MDA含量明显高于对照组（P＜0.05），且高剂量BPA暴露组血清MDA含量明显高于低剂量BPA暴露组（P＜0.05）；不同剂量BPA暴露组子代雄性大鼠血清SOD活性均低于对照组（P＜0.05）。见表4。

表3 孕期BPA暴露对子代大鼠血清脂质过氧化指标的影响（x±s）

3 讨论

BPA作为一种重要的工业添加剂，全球产量在2011年达到约560万t/a，中国总产量达到61.6万t/a［7］。BPA在世界各地环境中均有检出，调查显示日本全国水境BPA的检出率为68%，德国饮水中BPA的浓度范围300 pg/L～2 ng/L，北京市污水系统污染物中BPA的含量高达825 ng/L［8］。BPA能够通过模拟雌激素活性，DNA甲基化修饰等方式导致生殖系统损伤，这种影响可以发生在胚胎期、青春期和（或）成年期。生殖系统在发育期对激素样活性物质特别敏感，此时激素水平的改变则会对生殖系统产生终生的影响。有研究表明早期接触BPA会长期影响睾丸发育以及精子的发生，但其影响机制目前尚不明确［9］。

体重是评估受试毒物暴露对实验动物一般状况影响的综合指标，能较敏感而客观地反映生物体染毒后的全身营养状况和整体机能的改变。在周芩［10］的研究中，各染毒组染毒剂量增高，小鼠体重增长量越来越小，高剂量组体重增长量明显低于对照组。本实验研究结果也显示孕期BPA暴露实验组子代雄性大鼠的体重明显低于对照组（P＜0.05），说明孕期BPA暴露对子代雄性大鼠的体重具有一定的影响。与此同时精子数量一定程度上反映了生物体的生殖能力。化学物对各级生精细胞生长和发育产生了毒性作用，这往往是精子数减少的重要原因。本研究中高剂量BPA（100 mg/kg）孕期暴露能引起子代雄性大鼠精子数的减少，这一现象可能由于BPA具有透过大鼠血睾屏障的能力，因而干扰大鼠精子的生长和发育过程，对大鼠的生殖系统产生损伤。精子运动被认为是生育力最重要的指标之一。在Ficsor等［11］的研究中，用丝裂霉素C染毒大鼠后，结果发现第1、3、10周给药后出现精子活动度下降。本研究中，33.3 mg/kg与100 mg/kg BPA孕期暴露可引起子代雄性大鼠精子活动百分数明显下降，这可能与BPA造成的精子能量代谢紊乱有关，也可能与畸形精子数目增高有关。在李玉华等［12］的研究中，BPA暴露组与对照组间的生殖系统脏器指数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究中，不同剂量BPA孕期暴露组子代雄性大鼠附睾系数与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。由于李玉华的研究中BPA染毒剂量设置为5 μg/kg 、50 μg/kg，远低于本实验中低剂量组33.3 mg/kg，虽影响分子机制但附睾系数并无明显改变。考虑是BPA染毒时剂量不同造成的影响，导致本实验中附睾系数变化明显。但3组肝脏系数、肾脏系数及睾丸系数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

氧化应激是外源化学物对机体损伤的常见形式，孕期BPA暴露影响子代雄性大鼠脂质过氧化水平。本研究检测了脂质氧化应激过程中MDA、H2O2、抗氧化酶类CAT、SOD等常见氧化产物的变化。本研究中不同剂量BPA暴露组SOD活性降低，机体氧化系统平衡被破坏，保护能力下降。王承敏［13］的研究发现，大鼠睾丸支持细胞经BPA处理后，高剂量处理组支持细胞内SOD活性降低，所有BPA染毒剂量组支持细胞内MDA的含量均显著升高。提示BPA暴露可能破坏生殖系统氧化系统的平衡，造成生殖系统的损伤。本研究结果同时发现，100 mg/kg BPA孕期暴露可导致子代雄性大鼠血清MDA、H2O2含量升高，表明孕期BPA暴露对子代雄性大鼠血清H2O2和MDA的含量、SOD的活性产生一定程度的影响。

在马明月等［14］的研究中，母鼠孕期暴露BPA，与对照组相比，10、50、250 mg/kg BPA暴露组子代雌性大鼠睾酮水平明显下降（P＜0.05）；50 mg/kg BPA暴露组子代雌性大鼠LH、FSH、E2水平明显下降（P＜0.05）。提示BPA有可能通过下丘脑-垂体-性腺轴对大鼠生殖系统产生影响。在全超［15］的研究中，孕后期BPA暴露能造成子代雄性SD大鼠内分泌紊乱与氧化应激，同时抑制睾丸组织内Akt/mTOR信号转导通路，激活线粒体凋亡通路，诱导睾丸组织凋亡，导致大鼠精子质量下降。

综上所述，孕期BPA暴露可损伤子代雄性大鼠生殖系统，对大鼠生长发育产生一定影响。大量互相矛盾的数据存在于低剂量BPA研究中，造成这种现象的原因不仅与暴露方式、暴露剂量、暴露阶段等原因有关，更可能与雄性大鼠体内BPA具有高度复杂的分子作用机制有关。这种复杂的机制，导致了实验结果呈现多样性。BPA对雄性生殖系统的影响尚需进一步研究。