SAHA影响乳腺癌MCF-7细胞增殖的分子机制研究

刘春阳，周伟强

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2016级，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳医学院基础医学院，辽宁省环境污染与微生态重点实验室）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其中雌激素依赖型乳腺癌占大多数［1］。与激素非依赖型乳腺癌相比，雌激素依赖型乳腺癌通过雌激素受体（estrogen receptor，ER）介导细胞内信号转导通路激活，引发基因组和非基因组效应以调控乳腺细胞生长、发育和凋亡［2］。当ER信号通路发生失调时，可导致相关基因表达失衡或改变细胞质内蛋白功能，促使乳腺细胞过度增殖或凋亡受阻，从而导致乳腺癌的发生［3-4］。因此深入研究ER信号通路对揭示乳腺癌的发病机制以及寻找更有效的乳腺癌治疗药物有重要意义。本文将去乙酰化酶抑制剂SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）与乳腺癌ER阳性细胞系MCF-7共同作用，研究乳腺癌细胞在去乙酰化状态下，ER信号通路的变化情况，探讨在乳腺癌发生过程中ER信号转导途径与去乙酰化修饰之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞株MCF-7由本实验室冻存；RPIM-1640培养液、胎牛血清、青霉素和链霉素购自美国Thermo公司；固相细胞凋亡抗体芯片试剂盒购自美国R&D公司；人重组Leptin蛋白、SAHA及其它化学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人乳腺癌MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的链霉素的RPIM-1640培养液中，待细胞铺满80%左右时用于以下各项实验。

1.2.2 全细胞蛋白提取 将大约1×107个/ml乳腺癌MCF-7细胞接种于100 mm培养皿中，细胞在无血清RPIM-1640培养液中进行同步化处理24 h。加入0.625 nmol/L Leptin和10 μmol/L SAHA与MCF-7细胞孵育24 h。将处理后的MCF-7细胞经胰蛋白酶消化，14 000×g离心5 min后取细胞团块经M-PER裂解液裂解。用BSA标准品配制梯度稀释的蛋白标准品用于标准曲线的绘制。将BCA反应液A和B管按50∶1（v∶v）配制反应液后，取 25 μl各样品液与200 μl BCA 反应液混合后37℃水浴箱中孵育30 min。应用酶标仪在562 nm读出吸光度（OD）值后根据标准曲线计算出样本浓度。

1.2.3 固相细胞凋亡抗体芯片检测 将已包被抗体的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜加入封闭液中孵育1 h。将200 μg试验组和对照组蛋白样品液分别加入试剂盒4孔板各孔中4℃孵育过夜。将偶联蛋白样品的PVDF膜用PBS冲洗后滴加1.5 ml生物素标记的二抗孵育1 h。PVDF膜经PBS冲洗后加入辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉亲和素作用30 min。将等体积混合的ECL化学发光底物A、B液加在PVDF膜上显色5 min。应用化学发光成像系统曝光10 min，采用Gel-pro Analyzer软件（美国Media Cybernetics公司）计算膜上各抗体标记点的灰度值，以PVDF膜上参照点的灰度值为对照来研究SAHA对MCF-7细胞凋亡蛋白表达的影响。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAHA抑制乳腺癌细胞周期G1-S期调控因子的表达 固相细胞凋亡抗体芯片结果显示，与空白对照组相比，SAHA显著增强MCF-7细胞中Bax、p21CIP1和 p27KIP1蛋白的表达，并抑制 Survivin蛋白的表达；Leptin则抑制Bax、p21CIP1和 p27KIP1蛋白的表达，增加Survivin蛋白的表达。见图1。

2.2 SAHA对乳腺癌细胞凋亡蛋白表达的影响 固相细胞凋亡抗体芯片结果显示，与空白对照组相比，SAHA处理后MCF-7细胞内Capase-3、TRAIL DR5的表达水平显著上升，而Claspin、Clusterin和XIAP的表达水平明显下降。而Leptin则抑制MCF-7细胞中Caspase-3、TRAIL DR5蛋白的表达，增加Claspin、Clusterin和XIAP蛋白的表达水平。见图2。

3 讨论

有研究表明，以SAHA为代表的HDAC抑制剂有明显的促使肿瘤细胞生长停滞、诱导肿瘤细胞的分化和凋亡的特性。其具有抗癌的广谱性、特异性，并具有毒性较低的特点，是一类具有良好应用前景的抗癌新药［5］。ER阳性乳腺癌是一种雌激素依赖性肿瘤，雌激素的作用是由ER介导的，在基因水平上ER受其上下游相关基因调控。相关研究表明，ER基因及其调控基因与乳腺癌的发生、发展密切相关［6］。因此，本研究选取ER阳性乳腺癌细胞MCF-7，利用固相细胞凋亡抗体芯片研究SAHA对MCF-7细胞增殖影响的分子机制。

图1 SAHA对乳腺癌MCF-7细胞周期调控蛋白表达的影响

图2 SAHA诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡蛋白的表达

从本实验结果中可以看出，SAHA显著增强MCF-7细胞中调控细胞周期G1-S期的p21CIP1和p27KIP1蛋白的表达，并抑制Survivin的功能；另外SAHA还增加了细胞凋亡相关蛋白Bax、TRAIL DR5和Capase-3的表达水平，对Claspin、Clusterin和XIAP的表达水平明显下降。Bax作为一种重要的凋亡促进因子通过形成二聚体而抑制凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-x的表达［7］。而Survivin作为重要的凋亡抑制因子，可直接抑制Caspase活性，促进癌细胞的异常增殖和恶性转化［8］。XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein）是凋亡抑制蛋白家族成员，同样也是通过抑制Caspase分子的活性而对细胞凋亡产生抑制作用［9］。Clusterin可通过与细胞质中Bax共同作用抑制细胞色素C的释放而达到保护细胞的目的［10］。Claspin作为ATR依赖的DNA复制限制点调控重要的调节子，参与细胞周期S期DNA复制过程中复制叉的延长和稳定［11］。p21CIP1和 p27KIP1作为细胞周期重要的负调节因子，可抑制细胞周期调控系统中Cyclin D1-CDK4和Cyclin E-CDK2的表达，使细胞周期停滞在G0/G1期［12-14］。

综上所述，SAHA通过调控细胞周期调控蛋白和凋亡相关蛋白的表达而达到抑制乳腺癌细胞增殖的目的。