急性酒精中毒患者儿茶酚氧位甲基化转移酶基因多态性分析*

冯 锴 姜树朋 汪 明 李 艳

急性酒精中毒是指在短时间由于摄入酒精后出现的中枢神经系统紊乱状态，多表现为行为和意识异常，严重损害肝脏功能，导致呼吸循环衰竭，进而危及生命[1]。研究显示，酒精中毒会发生神经递质的改变，尤其是多巴胺系统。儿茶酚氧位甲基化转移酶(Catechol-O-methyltransferase，COMT)是中枢神经系统多巴胺的主要降解酶，在多巴胺系统功能中起着至关重要的作用[2-5]。COMT 基因位于人类22 号染色体长臂1 区1 带2 亚带(即22q 11.2)，包含有6 个外显子，其中最重要的基因多态性位点为COMT rs4680， COMT基因的第4号外显子472位的G被A置换发生点突变，使其编码的158位密码子的氨基酸由缬氨酸(Val)被甲硫氨酸(Met)取代，导致酶活性降低。单核甘酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病相关的基因组突变。本研究建立两对交叉引物-聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction with Confronting Two-Pair Primers，PCR-CTPP)检测COMT rs4680基因多态性，并用以检测分析348例健康人群和288例急性酒精中毒患者COMT rs4680基因多态性，分析该位点多态性与急性酒精中毒的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015-06—2017-10本院急诊就诊的288例急性酒精中毒患者(急性酒精中毒组)，诊断均符合2014年版《急性酒精中毒诊治共识》[1]，其中男267例，女21例，年龄25±8岁。选择同期体检健康人群348例为健康对照组，男313例，女35例，年龄26±5岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(χ2=1.50，t=0.92，P>0.05)，具有可比性。

1.2 仪器与试剂

体液DNA磁珠法提取试剂盒(上海星耀医学公司)、2×Taq PCR Master Mix(上海莱枫公司)、PCR 引物(大连宝生物公司)、西班牙琼脂糖Biowest Agarose(武汉科昊佳公司)、Gel-Red核酸染料(北京Biotech公司)、6×Loading Buffer(大连宝生物公司)、DL1000/2000 DNA Marker(大连宝生物公司)、BigDye Terminator v3.1(美国ABI公司)、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(美国Axygen公司)、3M醋酸钠(pH5.5)(美国ABI公司)；主要仪器为生物安全柜(美国Thermo公司)、微量移液器(德国Eppendorf公司)、Smart LabAssist-32 核酸提取仪(上海星耀医学公司)、DW-86L628超低温冰箱(青岛海尔集团)、Vortex-5涡旋振荡器(郑州南北集团)、MK2000-2E干式恒温器(郑州南北集团)、5430R型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、NanoDrop 2000c型分光光度计(美国Thermo公司)、低速台式离心机(北京白洋公司)、Veriti梯度PCR仪(美国ABI公司)、3500DX型基因测序仪(美国ABI公司)、DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)、G:BOX Chemi XT4型全自动凝胶成像分析系统(英国SYNGENE公司)，已测序鉴定的COMT A/G杂合子DNA模板由本实验室提供。

1.3 方法

1.3.1血液样本采集与处理：分别采集健康对照组和急性酒精中毒组外周血1ml，EDTA-K2抗凝，按DNA提取试剂盒说明书提取外周血DNA于-70℃保存待检。

1.3.2引物设计：基于PCR-CTPP扩增原理[6]在NCBI数据库中搜索COMT rs4680多态性位点所在序列，设计两个内引物F1和R1及两个外引物F2和R2：F1：5’-CGG ATG GTG GAT TTC GCT GTC A-3’；R1：5’-AGG CAT GCA CAC CTT GTC CTT AAC-3’；F2：5’- GCT CCT GCT CTT TGG GAG AGG T -3’；R2：5’- GTT TAC CCA GAG CTG TGA GAC CCT C-3’。经过聚合酶链反应可得到三种产物，分别是G等位基因产物、A等位基因产物、非特异性产物(内参照)[7,8]，在两个内引物F1和R1的3’端到倒数第三位引入一个人为错配碱基。

1.3.3PCR-CTPP反应体系建立：优化内外引物浓度比，以获得重要参数的最优组合[9-12]：分别以F1与R1、F2与R2为引物对,设置内外引物比为(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)优化引物浓度。通过将已测序鉴定的COMT A/G杂合子DNA模板做梯度稀释(100ng、80ng、60ng、40ng、20ng、10ng、5ng、2ng)，探索本系统的最低检测限。优化反应体系，反应结束后取8μl PCR产物，通过2%的琼脂糖凝胶电泳，使用G:BOX Chemi XT4成像系统拍照，根据条带大小和有无鉴别基因型。

1.3.4研究对象基因多态性检测：健康对照组和急性酒精中毒组按照优化好的PCR-CTPP方法进行COMT rs4680位点基因多态性检测。

1.3.5基因测序：取外引物扩增产物纯化后，采用引物F2、R2进行测序反应，再次纯化后上机进行一代测序。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 PCR-CTPP反应体系

反应体系总体积为20μl：PCR Premix 10.0μl、引物1.0μl(浓度为10μlmol/l)、模板DNA 1.5μl、无核酸酶水7.5μl。PCR反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，64℃复性30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃末延伸10min，4℃保存。在PCR后，取扩增后产物，经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析后COMT rs4680基因多态性见图1，条带大小依次为非特异性产物497bp，G等位基因产物305bp，A等位基因产物227bp。C1、C5泳道为COMT rs4680 AG型，C2、C4泳道为COMT rs4680 GG型，C3、C6泳道为COMT rs4680 AA型。最优内外引物比为1∶1，最低检测限为5ng。

图1 COMT rs4680基因多态性分型结果

2.2 PCR-CTPP基因分型结果验证

取2.1中C1、C2、C3标本行基因测序检测，分析COMT rs4680基因多态性，测序结果与PCR-CTPP基因分型结果一致，见图2。

图2 COMT rs4680基因多态性测序图

2.3 急性酒精中毒组和健康对照组COMT rs4680基因多态性分析

两组基因多态性分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=2.97，P>0.05)。PCR-CTPP方法检测COMT rs4680基因多态性结果显示，两组GG型、AG型、AA型三种基因型分布差异具有统计学意义(P<0.05)，急性酒精中毒组COMT rs4680 AA型检出率明显高于健康对照组(χ2=5.93，P<0.05)；但两组G、A两种等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组COMT rs4680多态性情况比较

注：与健康对照组比较，1)P<0.05

3 讨论

本研究成功建立PCR-CTPP单管检测COMT rs4860基因多态性体系，分型成功。本研究建立的PCR-CTPP检测技术可在任何具备常规PCR条件的实验室开展，只需设计两对引物，经过PCR、琼脂糖电泳分析即可鉴别COMT基因型，与传统的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)相比，PCR-CTPP不需要限制性酶切位点，省去了酶切的费用与时间；与等位基因特异性PCR(AS-PCR)相比，PCR-CTPP可单管检测基因多态性；与DNA测序相比，PCR-CTPP检测基因多态性省时省力，避免了后续的胶回收、测序反应等复杂步骤[10,11]。但PCR-CTPP技术对引物的设计要求严格：两条内引物受制于多态性位点，内引物中需要引入除多态性位点之外的第二个错配碱基，以提高扩增的特异性；四条引物必须有相近的退火温度，避免竞争性扩增出现假阴性[11-13]。

急性酒精中毒可在短时间内给患者带来较大伤害，甚至可以直接或间接导致患者死亡。本研究探索了急性酒精中毒患者COMT基因多态性与急性酒精中毒的关系，显示COMT rs4680 AA型可能是急性酒精中毒发生的高危因素之一，COMT基因多态性可能影响酒精中毒的发生或发展。酒精中毒的神经生物学包过神经递质的改变，例如，多巴胺。而COMT在神经系统多巴胺中发挥着重要作用，参与儿茶酚胺的降解。目前关于COMT与酒精中毒的相关性研究较少，但相信其相关性研究必将成为未来的重要方向。

上述所述，本研究建立的PCR-CTPP可用于COMT rs4680基因多态性检测，且基因多态性结果表明COMT rs4680 AA可能是急性酒精中毒发生的高危因素之一。

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