阿魏酸对糖尿病小鼠心肌病变的影响及其机制*

徐慧琳， 徐郭， 姚 君， 郭 玮， 项 楠， 王旭焘， 齐敏友

(浙江工业大学药学院药理研究所， 杭州 310014)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是一种独立于高血压、动脉粥样硬化及其他心脏病变的特异性心肌病，是糖尿病最常见的微血管并发症[1]。DCM的病理生理机制与高血糖、氧化应激、心肌纤维化等有关[2]。近几年研究发现，在糖尿病状态下，过表达的转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)通过促进心肌纤维重要组成成分Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ)合成，引起心肌纤维化[3]。阿魏酸(ferulic acid, FA)是一种酚类化合物，广泛存在于木贼、升麻、阿魏等天然中草药中，具有增加冠脉血流量、保护心肌缺血、抗血小板聚集等药理功效[4-5]。Choi等[6]研究报道，阿魏酸通过减轻肾脏组织氧化应激和炎症反应对Ⅱ型糖尿病大鼠肾脏具有保护作用。但FA能否通过抑制心肌组织TGF-β1和collagen Ⅲ表达对Ⅱ型糖尿病小鼠心肌起保护作用，尚未见报道。本实验通过高糖高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 诱导建立的Ⅱ型糖尿病小鼠模型，研究FA对小鼠糖尿病心肌病的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

链脲佐菌素(HPLC≥98%, 美国Sigma公司)；阿魏酸(HPLC≥99%, 西安开来公司)；血糖仪、血糖试纸(Onetouchultraeasy, 美国Johnson公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒(南京建成公司)；兔抗小鼠TGF-β1抗体、兔抗小鼠collagen Ⅲ抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；小型离心机(centrifuge 5418, 德国Eppendorf公司)；超纯水仪(PureLab Classical, 英国ELGA)；均质分散机(D-160, 大龙兴创实验仪器北京有限公司)；可见分光光度计(Spectrum Lab S22pc, 上海光学仪器厂)。

1.2 实验动物与模型建立

健康雄性SPF级ICR小鼠30只，(20±2)g，由浙江省实验动物中心提供。随机选取20只小鼠高脂饮食(含70%普通饲料，15%蔗糖，15%猪油)连续喂养6周后，将STZ溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，腹腔注射(30 mg/kg)连续5 d，再隔9 d测空腹血糖，超过11.1 mmol/L视为糖尿病小鼠模型。20只糖尿病小鼠随机分为模型组和阿魏酸组(n=10)。另取10只正常小鼠为对照组，以普通饮食喂养6周后，腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，连续5 d。阿魏酸组以生理盐水溶解后灌胃(200mg/kg)，正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃，连续8周。

1.3 一般指标检测

小鼠末次给药后，禁食不禁水12 h，称重并测定空腹血糖。

1.4 样本收集

血样本留取：小鼠摘眼球取血，常温静置6 h，4 ℃离心(3 500 r/min，10 min)，取上清，-20 ℃冰箱保存待用。心脏质量指数(heart mass index, HMI)和左室质量指数(left ventricular mass index, LVMI)计算：处死小鼠，迅速取出心脏，排出心腔血液，剪除心耳及心包膜，生理盐水洗净后称取全心重，剪除心房及右心室，称取左室重；HMI=心脏重(mg)/体重(g)；LVMI=左心室重(mg)/心脏重(mg)。心肌组织样本留取：取适量心肌组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余左心室置-80 ℃超低温冰箱待用。

1.5 生化指标检测

按试剂盒说明书测定SOD活力和MDA含量。

1.6 病理学检测

心肌组织固定72 h后，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片，进行Masson染色，400倍光镜下观察。

1.7 免疫组化检测

石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2孵育10 min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡，抗原修复；10%山羊血清封闭后，孵育10 min，滴加兔抗小鼠TGF-β1和collagen Ⅲ抗体(1:100)，4 ℃过夜，PBS冲洗，滴加适量生物素标记二抗工作液，孵育20 min，PBS冲洗，滴加适量HRP工作液，孵育20 min，DAB显色剂显色，自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片。

400倍光镜下，每组选取9个视野进行拍摄，Image Pro Plus 6.0软件计算平均吸光度=积分吸光度/面积，并进行统计学分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 阿魏酸对一般体征、体重和血糖的影响

对照组小鼠精神良好，毛色洁白，饮食摄水正常，体重逐步增加。与对照组相比，模型组小鼠精神不振，毛色深黄，多饮、多食、多尿，体重显著降低(P<0.01)，空腹血糖显著升高(P<0.01)。与模型组相比，阿魏酸组小鼠精神较好，毛色较亮，“三多一少”症状明显改善；体重有所增加、血糖略有降低，但无统计学差异(P>0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of ferulic acid on body weight and fasting blood glucose of n=10)

BW: Body weight; FBG: Fasting blood glucose; FA: Ferulic acid

**P<0.01vscontrol

2.2 阿魏酸对各组小鼠HWI、LVMI的影响

与对照组相比，模型组小鼠HWI、LVMI增大(P<0.01)；与模型组相比，阿魏酸组小鼠HWI、LVMI减小(P<0.01，P<0.05，表2)。提示阿魏酸具有改善心脏肥大和左室肥厚的作用。

GroupHWI(mg/g)LVMI(mg/mg)Control3.2±0.20.58±0.05Model4.2±0.5**0.69±0.07**FA3.6±0.3##0.60±0.07#

HWI: Heart weight index; LVMI: Left ventricular mass index; FA: Ferulic acid

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.3 阿魏酸对各组小鼠心肌组织SOD活性、MDA含量的影响

与对照组相比，模型组小鼠SOD活力显著降低(P<0.05)，MDA含量显著增多(P<0.01)；与模型组相比，阿魏酸组小鼠SOD活力显著升高(P<0.05)，MDA含量显著减少(P<0.05，表3)，提示阿魏酸能够提高心肌组织抗氧化能力。

GroupSOD(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)Control110.1±18.52.9±0.8Model84.5±10.9*5.7±1.4**FA109.8±12.2#4.0±0.5#

SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde; FA: Ferulic acid

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.4 阿魏酸对各组小鼠心肌组织形态学的影响

Masson染色显示，正常组小鼠心肌细胞排列规则，胶原纤维少量存在；模型组小鼠心肌细胞排列紊乱、肥大，胞核肿胀，胶原纤维沉积，间质胶原纤维增生明显；阿魏酸组心肌细胞排列较为规则，细胞肥大较模型组有所减轻，肌纤维轻度变性，间质胶原纤维增生较模型组明显减少(图1，箭头所指处为纤维增生)。提示，阿魏酸能够有效减缓心肌纤维化的进程。

Fig.1Effects of ferulic acid on pathological changes (Masson ×400)

A: Control group; B: Model group; C: FA group; FA: Ferulic acid

2.5 阿魏酸对各组小鼠心肌组织中TGF-β1、collagen Ⅲ表达的影响

如图2,3和表4所示，免疫组化实验中，TGF-β1、collagen Ⅲ在心肌细胞胞浆和间质中均有表达。对照组小鼠两种蛋白质仅有少量表达；与对照组相比，模型组小鼠棕黄色颗粒明显增多，呈强阳性反应(P<0.01)；与模型组相比，阿魏酸组小鼠TGF-β1、collagen Ⅲ表达显著减少(P<0.01，P<0.05)。提示阿魏酸能抑制TGF-β1表达，减少collagen Ⅲ沉积。

Fig.2Expression of TGF-β1 in myocardial tissue of mice (× 400)

A: Control group; B: Model group; C: FA group

FA: Ferulic acid

Fig.3Expression of collagen Ⅲ in myocardial tissue of mice(× 400)

A: Control group; B: Model group; C: FA group

FA: Ferulic acid

GroupTGF-β1Collagen ⅢControl0.0957±0.01820.1198±0.0391Model0.2255±0.0111**0.2247±0.0071**FA0.1734±0.0182##0.1468±0.0210#

TGF-β1: Transforming growth factor-β1; FA: Ferulic acid

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 讨论

本实验通过高脂饮食结合小剂量STZ制备2型糖尿病模型。小鼠空腹血糖中等程度升高，表现出“三多一少”的症状，说明糖尿病模型造模成功。糖尿病小鼠心脏质量指数、左室质量指数增大，Masson染色显示心肌细胞肥大、胶原沉积，间质纤维化严重，符合糖尿病心肌病的典型病理特征。给予阿魏酸治疗8周后，各项指标明显好转，说明阿魏酸对糖尿病小鼠心肌组织具有保护作用。

众多研究表明，高血糖介导的氧化应激是糖尿病心肌病的主要诱因，氧化应激在糖尿病心肌病进程中起重要作用[7]。过度增强的氧化应激，导致体内活性氧生成增加，脂质过氧化终产物增加，心肌组织受到损伤[8]；而内源性抗氧化能力的降低，进一步加重了心肌组织损伤[9]。研究结果表明，模型组小鼠心肌组织MDA含量上升96.6%，SOD活力下降23.3%，说明糖尿病小鼠心肌组织氧化应激增强，抗氧化能力减弱；经阿魏酸给药后，糖尿病小鼠(阿魏酸组)心肌组织MDA含量下降29.8%，SOD活力上升29.9%，说明阿魏酸能减轻心肌组织氧化应激水平，增强抗氧化能力。

心肌间质纤维化是糖尿病心肌病的重要特征，与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成和降解失衡有关[10]。TGF-β1是ECM重要的调节因子，和心肌纤维化进程关系密切[11]。在糖尿病状态下，心肌组织TGF-β1表达上调，一方面刺激心脏成纤维细胞合成和胶原蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白分泌增多，引起心肌间质纤维化；另一方面通过抑制金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表达、促进金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)的表达，使胶原蛋白降解减少，胶原蛋白沉积，促进心肌间质纤维化[12]。实验结果显示，阿魏酸可以通过下调TGF-β1表达，减少collagen Ⅲ沉积，延缓心肌纤维化进程。

综上所述，氧化应激和纤维化参与了高糖高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠心肌病变的过程。阿魏酸通过抗氧化作用，抑制TGF-β1表达，减少collagen Ⅲ沉积，延缓了糖尿病心肌病变进程。本实验为阿魏酸治疗糖尿病心肌病提供了重要的理论依据。